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METHOD FOR PRODUCING INDOLE DERIVATIVE
(2013-10-17)
Chiu Hsien-Tai
The present invention provides a method for in vitro producing an indole derivative in a one-pot reaction. The method for producing a rhamnosylated indolocarbazole compound includes the steps of transforming a plasmid carrying a gene encoding N-glycosyltransferase into a bacterial strain; expressing the gene encoding N-glycosyltransferase in the bacterial strain; lysing the bacterial strain to obtain a crude enzyme extract; and adding TDP-glucose, an indolocarbazole aglycone and a metal ion in the crude enzyme extract for performing an enzymatic reaction to form the rhamnosylated indolocarbazole compound. Alternatively, the method for producing an indole-3-carboxaldehyde analog includes the steps of transforming a plasmid carrying a gene encoding NokA of Nocardiopsis sp. K-252 into a bacterial strain; expressing the gene encoding NokA in the bacterial strain; lysing the bacterial strain to obtain a crude enzyme extract; and adding an L-tryptophan analog for performing an enzymatic reaction to form the indole-3-carboxaldehyde analog.
Method for producing indole derivative
(2014-04-01)
Chiu Hsien-Tai
The present invention provides a method for in vitro producing an indole derivative in a one-pot reaction. The method for producing a rhamnosylated indolocarbazole compound includes the steps of transforming a plasmid carrying a gene encoding N-glycosyltransferase into a bacterial strain; expressing the gene encoding N-glycosyltransferase in the bacterial strain; lysing the bacterial strain to obtain a crude enzyme extract; and adding TDP-glucose, an indolocarbazole aglycone and a metal ion in the crude enzyme extract for performing an enzymatic reaction to form the rhamnosylated indolocarbazole compound. Alternatively, the method for producing an indole-3-carboxaldehyde analog includes the steps of transforming a plasmid carrying a gene encoding NokA of Nocardiopsis sp. K-252 into a bacterial strain; expressing the gene encoding NokA in the bacterial strain; lysing the bacterial strain to obtain a crude enzyme extract; and adding an L-tryptophan analog for performing an enzymatic reaction to form the indole-3-carboxaldehyde analog.
Method for producing indole derivative
(2012-02-02)
Chiu Hsien-Tai
The present invention provides a method for in vitro producing an indole derivative in a one-pot reaction. The method for producing a rhamnosylated indolocarbazole compound includes the steps of transforming a plasmid carrying a gene encoding N-glycosyltransferase into a bacterial strain; expressing the gene encoding N-glycosyltransferase in the bacterial strain; lysing the bacterial strain to obtain a crude enzyme extract; and adding TDP-glucose, an indolocarbazole aglycone and a metal ion in the crude enzyme extract for performing an enzymatic reaction to form the rhamnosylated indolocarbazole compound. Alternatively, the method for producing an indole-3-carboxaldehyde analog includes the steps of transforming a plasmid carrying a gene encoding NokA of Nocardiopsis sp. K-252 into a bacterial strain; expressing the gene encoding NokA in the bacterial strain; lysing the bacterial strain to obtain a crude enzyme extract; and adding an L-tryptophan analog for performing an enzymatic reaction to form the indole-3-carboxaldehyde analog.
二磷酸核甘醣之組合式生物合成在藥物研發之應用(I)
(2002)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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交通大學生物科技研究所
二磷酸核甘醣之組合式生物合成在藥物研發之應用(II)
(2003)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技研究所
二磷酸核甘醣之組合式生物合成在藥物研發之應用(III)
(2004)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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交通大學生物科技研究所
二磷酸核脢去氧醣酮基還原酵素之化學機理與結構活性關係的研究與藥物修飾應用
(2007)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技學系(所)
醣類在自然界中扮演有結構、能源與分子辨識等的重要功能。許多致病微生物與含醣天然物都具有結構多樣的特殊醣類，如去氧醣與氨基去氧醣。含醣次級代謝物具有豐富多樣的藥性與生物活性，如抗生素、抗腫瘤、抗癌、免疫調節與殺蟲活性等。這些特殊醣分子常決定含醣次級代謝物的重要生物活性與標的專一性。二磷酸核.去氧醣為生物合成這些特殊醣分子的提供者與重要前趨物，本計畫即研究二磷酸核.去氧醣的生合成成熟步驟的關鍵酵素：四酮基還原酵素。目前科學界對DnmV 與SnogG 為代表的還原酵素的化學機理及結構活性關係的研究甚少，本研究將針對這兩種還原酵素，進行活性中心的分子辨識、化學催化與結構活性關係的深入探討，並用以生合成許多二磷酸核.去氧醣，而應用於修飾含醣次級代謝物的結構。本研究己具有初步成果，如己證明DnmV 的催化活性、己獲得其初步的蛋白質結晶結構及己發現其具鬆懈的受質專一性。本研究將進一步進行下列實驗：（一）依DnmV 蛋白質結構與序列關係，選擇重要活性中心胺基酸進行定點突變，並以酵素動力學分析其特有功能（二）SnogG 的基因選殖、功能性表現與蛋白質純化，並與DnmV 作動力學比較（三）以生合成與化學合成法，獲得各式二磷酸核.四酮基醣的類似物，對野生DnmV 與SnogG 進行活性檢視與動力學比較分析，探究受質結構與動力學關係，並因此生合成這些類似物的還原產物（四）選擇與醣類鍵結有關的DnmV 突變株，進行酮基醣類似物的活性與抑制動力學研究，並因此擴充酵素的不專一性，而生合成更多的還原產物（五）以二磷酸胸.及其類似物，進行野生或突變株的酵素抑制動力學，以解析其受質結構與蛋白質功能的關係（六）以實驗所得之各式還原醣，修飾含醣藥物的醣.，以得其多樣的醣化衍生物，作為生物活性測試之用。本研究所探討的兩種還原酵素，催化立體化學專一的還原反應，並具接受多樣受質類似物的能力，其化學機理與特殊的分子辨識有趣且值得研究，可促進對醣修飾與生合成酵素的結構與活性關係的認識，以進行蛋白質工程。並可應用此類酵素合成更多樣的醣分子，來修飾具生物活性的含醣次級代謝物，相信對於促進藥物的結構多樣性與研發有所助益。
﹝口引﹞﹝口朵﹞類N醣基轉移酵素的化學酵素法在酵素機制與藥物生合成之研究
(2005)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技學系(所)
天然二次代謝物為結構複雜且多樣生物活性的有機分子。..類配醣體(Indolocarbazole glycosides)為結構特殊的成員，且帶有多樣的醣分子修飾。其特殊的化學骨架使..類配醣體具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗腫瘤與抗癌等重要生物活性。例如Rebeccamycin 可抑制拓樸異構.(DNA Topoisomerase I)的DNA 切割或其激.(Kinase)之活性，其衍生物已進到抗癌與抗腫瘤之臨床試驗。星狀孢菌素(Staurosporine)亦屬此類，已被證實可抑制重要生理相關之各種蛋白質激.，具抗腫瘤之功效。自然界生物合成含醣..類天然物過程中，N-醣基轉移酵素(N-Glycosyltransferase)扮演催化醣基連結的關鍵性步驟，使其成熟而具有活性。由於醣基具有多樣官能基，可與生物或生理作用的目標形成精確的分子認知作用，使醣基的種類與結構官能性成為生物活性與效力的重要決定因子。因此可以組合式設計的方式，利用N-醣基轉移酵素將各類醣基連結至..類醣.上。為此，對酵素之分子反應機制、動力學及結構的研究與洞悉便非常重要。所得資訊亦極有助於酵素的蛋白質工程研究，用以轉接任意不同的醣基結構於各類醣.上，作為藥物研發與醫學治療用。本計畫針對Rebeccamycin、Staurosporine 及K252a 等三種..類配醣體進行試管內生化功能與分子反應機制之研究。將相關基因進行選殖，異體表現並大量純化其酵素蛋白質，以各種醣.與二磷酸核.醣之組合作功能性活性測試，並進行下列研究：(一)各受質組合之動力學研究，並研究結構與活性關係(二)針對未具反應性之受質類似物(醣基或醣.)進行抑制動力學，以瞭解控制受質專一性的分子認知因子(三)以定點突變法鑑識保留性胺基酸之可能生化功能(四)催化合成之新型..類配醣體可用於生物活性測試，以初步評估抑制活性。天然有機分子至今依然是藥用研發的重要物質與靈感來源。二次代謝物配醣體已被證實能治療各類疾病與嚴重的致病微生物感染。如今癌症病例遽增且多重藥物抗藥性問題日趨嚴重，迫切須要發展更多且少副作用之治療藥劑，而..類配醣體為深具研發潛力之天然物。然而，至今對生物合成此類天然物之重要N-醣基轉移酵素之試管內功能、催化機制與結構卻仍一無所知；且對此類醣基轉移酵素家族之蛋白質結構與演化之所知甚少，本計畫研究目的即在深入研究此類酵素，以為將來發展..類配醣體成為醫療製劑之應用。
天然抗癌藥物K-252a醣基生合成的化學分子機制研究與其衍生物的合成應用
(2010)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技學系（所）
K-252a 是一種結構特殊的含醣天然藥物，對多種生物體中的重要蛋白質激酶有強效的抑制作用，因此能對各種癌症有廣泛且有效的抑制藥性，另外，K-252a 也具有抑制神經退化衰竭而達到神經保護的作用。此一天然有機分子是由吲哚醣苷K-252c 與特異的雙氫鏈黴醣 (dihydrostreptose)，經由兩個碳-氮醣苷鍵連結而成，其一為醣基轉移酵素摧化形成。最近，這個重要天然物的完整生物合成基因群組已由我們所發表，我們發現K-252a 的生合成可能利用二磷酸核苷雙氫鏈黴醣作為醣的提供者，而藉由醣基轉移酵素而連結至醣苷。至今，科學家對二磷酸核苷鏈黴醣的生物合成途徑所知甚少，其所參與酵素群的化學分子機制亦不明瞭。本研究將針對K-252a 生合成途徑與酵素群，進行以下探討：(一)於異體物種中選殖、表現與大量純化二磷酸核苷雙氫鏈黴醣的酵素群蛋白質，並合成所有可能的醣類前驅物與中間產物，以功能性活性驗證、終止反應法、及中間產物餵食方法，來釐清並證明其化學反應途徑與催化機制。並運用定點突變法，配合酵素動力學，來探討鏈黴醣合成酵素活性中心的重要保留胺基酸，以發現其功能與分子機制。(二)利用四個K-252c 醣苷生合成酵素群，將一群色胺酸類似物，使用前趨物導向生合成的方式，合成出眾多組合的醣苷衍生物。(三)應用K-252a 醣基轉移酵素，將生合成、化學酵素法及化學合成的五元及六元環醣連接至醣苷上，而獲得一群(近千種)K-252b 及 K-252d 的類似物分子庫，並進而探討醣轉酵素對這些醣基的分子認知與專一性。(四)進行上述分子庫類似物的蛋白質激酶的抑制效果與親和力，而解析其藥物結構與標的活性的關係。總之，本研究藉由完成重要抗癌藥物K-252a 生合成酵素的分子機制探討，應用組合式生合成的方式，進行含醣天然藥物之衍生物合成，以提高藥物的選擇性與效能，達到藥物研發而解決或治療癌症與神經退化的病症。
天然抗癌藥物K-252a醣基生合成的化學分子機制研究與其衍生物的合成應用
(2011)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技學系（所）
K-252a 是一種結構特殊的含醣天然藥物，對多種生物體中的重要蛋白質激酶有強效的抑制作用，因此能對各種癌症有廣泛且有效的抑制藥性，另外，K-252a 也具有抑制神經退化衰竭而達到神經保護的作用。此一天然有機分子是由吲哚醣苷K-252c 與特異的雙氫鏈黴醣 (dihydrostreptose)，經由兩個碳-氮醣苷鍵連結而成，其一為醣基轉移酵素摧化形成。最近，這個重要天然物的完整生物合成基因群組已由我們所發表，我們發現K-252a 的生合成可能利用二磷酸核苷雙氫鏈黴醣作為醣的提供者，而藉由醣基轉移酵素而連結至醣苷。至今，科學家對二磷酸核苷鏈黴醣的生物合成途徑所知甚少，其所參與酵素群的化學分子機制亦不明瞭。本研究將針對K-252a 生合成途徑與酵素群，進行以下探討：(一)於異體物種中選殖、表現與大量純化二磷酸核苷雙氫鏈黴醣的酵素群蛋白質，並合成所有可能的醣類前驅物與中間產物，以功能性活性驗證、終止反應法、及中間產物餵食方法，來釐清並證明其化學反應途徑與催化機制。並運用定點突變法，配合酵素動力學，來探討鏈黴醣合成酵素活性中心的重要保留胺基酸，以發現其功能與分子機制。(二)利用四個K-252c 醣苷生合成酵素群，將一群色胺酸類似物，使用前趨物導向生合成的方式，合成出眾多組合的醣苷衍生物。(三)應用K-252a 醣基轉移酵素，將生合成、化學酵素法及化學合成的五元及六元環醣連接至醣苷上，而獲得一群(近千種)K-252b 及 K-252d 的類似物分子庫，並進而探討醣轉酵素對這些醣基的分子認知與專一性。(四)進行上述分子庫類似物的蛋白質激酶的抑制效果與親和力，而解析其藥物結構與標的活性的關係。總之，本研究藉由完成重要抗癌藥物K-252a 生合成酵素的分子機制探討，應用組合式生合成的方式，進行含醣天然藥物之衍生物合成，以提高藥物的選擇性與效能，達到藥物研發而解決或治療癌症與神經退化的病症。
天然物甲基轉移酵素的化學機理研究與在藥物研發之應用
(2006)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技學系(所)
自然界中，含醣二級代謝物因具豐富的結構多樣性，成為新穎藥物研發的重要來源，其生物活性含跨抗微生物、抗病毒、抗腫瘤及農業與醫藥用途等。二級代謝物生物合成途徑的酵素是建構其複雜結構的重要成員，甲基轉移酵素即是一種。甲基轉移酵素(甲轉.)在生物體中扮演重要的功能，如DNA 甲基化、tRNA 成熟化與天然物生物合成等。本計畫即是探討spinosyn 生合成途徑中三種甲基轉移酵素的功能機制，進而應用來製造一群二級代謝物之多樣性衍生物。本研究具體研究目標如下：(一)從微生物中轉殖、表現與大量純化三種甲轉.；(二)探討三種酵素的受質、結構、生化特性、輔因子與功能活性的關係；(三) 將製作一群結構多樣的受質衍生物，並探討甲轉.對受質分子認知的系統性關聯性；(四)應用許多本實驗室自行合成的抑制劑，來探索酵素活性中心的分子結構與活性關係；(五)應用基因突變(蛋白質工程)來鑑定功能重要之胺基酸，及其與受質、輔因子與蛋白質結構的關係；(六)將製造出一群多重甲基化衍生的含醣化合物，並評估其生物活性與功能，包含抗菌抑制活性等。(七)測試甲轉.或其突變株對其他含醣二級代謝物的甲基化能力。(八)進一步純化三種甲轉.，以為X-射線結晶結構鑑定用。甲轉.負責很多具重要生物活性之二級代謝物的生合成並重要影響其結構多樣性。本研究旨在應用其對一系列本實驗室組合式自製的受質衍生物的動力學表現，系統性地分析並揭發控制其分子認知與機制的重要因素與理論。再結合蛋白質變異實驗，首次藉由本研究在分子與酵素層次上深入探討二級代謝物氧基甲轉.。尤其可貴的是，本研究可以實質上合成新穎的一群甲基化含醣化合物，對新穎藥物研發與生物活性開發深具潛力。總之，本研究不僅在學術上深入瞭解甲轉.家族的特性 (尤其是二級代謝物生合成有用的甲轉.)，並且亦進一步促進組合式生物合成的發展應用，以作為藥物研究發展之用。
特殊去氧醣胺基轉移酵素的分子機制研究與其在胺基醣藥物的組合式生合成應用
(2008)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技學系(所)
胺基化對生物體內的有機分子的代謝、結構多樣化與功能化上扮演重要的角色。尤其，很多具生物活性的含醣次級代謝物因具有特殊胺基醣而具有重要生物活性，如抗生素、抗腫瘤、抗癌、甚至抑制害蟲的活性。在自然界中，這些胺基醣化合物皆需藉由二磷酸核苷醣胺基轉移酵素而得以用立體與位向專一性的方式，將胺基轉移至各式的醣分子結構上。這類酵素如何演化，而在辨識並包容各式醣類結構下轉移胺基，已儼然成為有趣且重要的研究課題。經由我們許多初步的研究成果顯示，此類胺基轉移酵素對醣分子受質具有驚人的受質不專一性，這結果對藉以製作各式胺基醣，來增加胺基醣藥物的結構多樣性，具重要影響與意義。鑒於上述的前景與重要性，本計畫將以三號與四號胺基轉移酵素為研究對象，徹底解析在此類酵素活化中心的結構與活性關係。另外，由於現今對此特別族群的受質專一性與反應機制的所知有限，本計畫亦特別選擇三種重要天然藥物的去氧醣胺基轉移酵素來探討上述課題。主要策略是，以化學或生物合成一群二磷酸胸腺嘧啶三號及四號酮基醣類化合物，來作為探測酵素活性中心結構的分子探針，並以一連串有系統的動力學(包含抑制動力學)實驗，來鑑定酵素的受質專一性，及立體與位向專一性。同時，並利用蛋白質定點突變法，配合酵素動力學，來搜尋參與化學催化和受質辨識的重要活性胺基酸的功能與角色，一方面亦可藉由酵素突變種來獲得更佳的受質包容度。這些實驗結果，將得以藉由轉胺作用來合成一群各式的二磷酸核苷胺基醣，並進一步用來胺基醣化吲哚醣苷，而得各種具有藥物潛力的吲哚胺基醣衍生物，作為疾病治療之應用。
醣基轉移脢在組合式生物合成上之研究與應用
(2000)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技研究所
重要抗生素C-甲基化的生合成分子機理研究與在新穎抗癌藥物的研發應用
(2009)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技學系(所)
生物活性分子的甲基化是自然界的一種重要機制，其參與細胞各項活性機能並操控生物分子的生物活性，譬如細胞分化、基因表現的調控、後轉譯修飾、tRNA 的成熟、抗藥機制、及天然物的生物合成等。在無以數計的具有重要生物活性的天然物中，常發現具有結構多樣性的醣分子成份。研究顯示，該醣分子為其生物活性所必須，且其醣基的化學結構，可決定該天然物的效能與專一性。值得注意的是，這些醣分子的碳骨架上常帶有被C-甲基轉移酵素修飾的甲基，此C- 甲基化，使其醣分子更具有多樣性的分子構型，並調控其疏水性分布。因此，瞭解這些醣類C- 甲基轉移酵素的分子認知與機制，及其在天然物生物合成中扮演的角色，便成為一有趣且重要的研究課題。為探討此課題，本研究即從四個具有抗癌、抗腫瘤與抗生素活性的含醣天然物生合成途徑中，找得四種代表性類型(含三號碳與五號碳)的C-甲基轉移酵素，以進行其功能性表現、分子機制與受質專一性的研究。本研究從產生此四種天然物的微生物中，選殖、表現並純化這四種C-甲基轉移酵素，以二磷酸核苷四號酮基六號去氧葡萄醣及其光學異構物，進行功能性表現與產物化學結構鑑定。而後，並使用一群四號酮基醣受質類似物，作為探測酵素活性催化中心的立體結構的探針，進行一系列酵素動力學與抑制學實驗，統整分析其動力學結果，以破解其受質分子認知與催化機制的原理，並解析歸納不同C-甲基轉移酵素的演化差異與特性。另外，本研究將以定點突變的方式，配合酵素動力學，鑑定出催化機制中扮演鹼基與重要功能的活性中心胺基酸。此外，研究中亦探討並比較此四種酵素的生化特性，如金屬離子依賴性、酸碱值與酵素活性的關係等。另一研究主題是，本研究將利用此四種不同C-甲基轉移酵素，以組合式化學的方式，催化合成一群甲基化二磷酸核苷醣分子資料庫。此實驗可以四種C-甲基轉移酵素混合排列，進行各式酮基醣的C-甲基化而成，並可再進一步搭配兩種立體催化化學不同的四號酮基去氧醣還原酵素，或化學還原法，而得還原形式的各式甲基化二磷酸核苷醣分子。此醣分子資料庫可充份應用於醣生物學，及天然物生合成與醣基化研究上。例如，本研究將應用此醣分子庫，以抗生素N- 醣基轉移酵素來轉移各式甲基化醣基，以修飾並合成一群含醣吲哚類抗癌抗腫瘤化合物，以作為抗癌症藥物的研發與應用。此研究成果並將有助於解決現今日益嚴重的抗生素與抗癌藥物的抗藥性及副作用問題。
鼠李醣轉移酵素之反應機制研究與其在藥物研發之應用
(2001)
邱顯泰
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Chiu Hsien-Tai
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國立交通大學生物科技研究所