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利用db/db與ACE2雙基因剔除小鼠模式探討腎素-血管收縮素系統的調節對糖尿腎病病程的影響
(2016)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系（所）
利用db/db與ACE2雙基因剔除小鼠模式探討腎素-血管收縮素系統的調節對糖尿腎病病程的影響
(2015)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系（所）
利用乳腺上皮細胞建構---可合成與分泌醫藥用重組蛋白質之類乳腺組織生物反應系統
(2008)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系(所)
我們已由泌乳母猪乳腺組織中分離出一自發可持續繼代生長的乳腺上皮細胞株，此稱為SI-PMEC（spontaneously immortalized porcine mammary epithelial cells），培養在適當基質的SI-PMEC 細胞於泌乳激素刺激下，可分化形成類乳腺組織形態，即形成具泌乳功能性的乳腺泡、腺管及腺側芽等結構，並大量表現、合成及分泌乳蛋白質。SI-PMEC 細胞可被用來測試將應用於基因轉殖泌乳動物，構築有乳腺專一表現調控序列之轉殖基因（transgene）的表現功能；SI-PMEC 細胞也可被用來建構一生產外源重組蛋白質的生物反應系統，該產物應會經過轉譯後的修飾作用，因此可保有原本蛋白質的結構與功能。據此，本計畫主旨為利用乳腺上皮細胞建構一可合成與分泌醫藥用重組蛋白質之類乳腺組織生物反應系統，在此三年期計畫中包括三項研究主軸，其分別為 (1) 篩選一在膠原蛋白基質上具分化功能的乳腺上皮細胞株，(2) 由山羊 β-酪蛋白（casein）基因調控序列構築而成的表現載體；(3) 建立一中空纖維束生物反應系統（hollow fiber reactor）。研究策略一：馴化、篩選一遺傳穩定而生長快速的乳腺上皮細胞株，此株細胞對動物血清與荷爾蒙的需求性降低，增殖時間不應超過24 小時。同時此細胞株在膠原蛋白基質上仍具有可分化成能合成與分泌乳蛋白質功能的類乳腺組織結構之性質。研究策略二：構築一系列在乳腺與乳腺上皮細胞中可被誘發高表現的載體，其表現調控序列為山羊 β-casein 基因。在這些表現載體的基因選殖位置的5’端是一約5 ∼ 6 kb DNA 片段，它包括 β-casein 基因起動子、exon 1、intron 1 及部分exon 2 等序列； 3’端是一約3 ∼ 4 kb DNA 片段，它為 β-casein 基因exon 7 往後延伸的序列。綠色螢光蛋白（green fluorescent protein）和螢光素酶（luciferase）報導基因將被構築於上述表現載體中，以用於測試SI-PMEC 細胞和生物反應器的功能。利用這些表現載體，我們也將構築可表現人類抗菌胜肽cathelicidin LL-37 與猪cathelicidin PR-39 之transgenes，此將用以轉染SI-PMEC 細胞以建立可高表現LL-37 和PR-39 的重組 SI-PMEC 細胞株（recombinant SI-PMEC; rSI-PMEC）。研究策略三：rSI-PMEC 細胞將被植入中空纖維束生物反應器之柱狀管內的中空纖維束外腔（extracapillary space; ECS），並供以生長培養基，細胞以貼附方式生長直到高緻密度（confluence）時，置換成分化培養基，此時細胞應在ECS 中形成類乳腺組織狀的網絡三維結構，並持續合成與分泌重組蛋白質，這些蛋白質產物將被濾過、釋放入反應器中空纖維束內（intracapillary space; ICS），並於ICS 循環流動的化學培養液中被逐漸濃縮。本研究的目標是可長期（至少42 天）將rSI-PMEC 細胞培養於中空纖維束生物反應系統中，並能持續高效率生產抗菌胜肽cathelicidin LL-37 and PR-39。此外，本計畫所建立的SI-PMEC、表現載體及中空纖維束生物反應器模式皆可被利用於生產其他生技藥物製品。
利用乳腺上皮細胞建構一可合成與分泌醫藥用重組蛋白質之類乳腺組織生物反應系統
(2007)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系(所)
我們已由泌乳母豬乳腺組織中分離出一自發可持續繼代生長的乳腺上皮細胞株，此稱為SI-PMEC（spontaneously immortalized porcine mammary epithelial cells），培養在適當基質的SI-PMEC 細胞於泌乳激素刺激下，可分化形成類乳腺組織形態，即形成具泌乳功能性的乳腺泡、腺管及腺側芽等結構，並大量表現、合成及分泌乳蛋白質。SI-PMEC 細胞可被用來測試將應用於基因轉殖泌乳動物，構築有乳腺專一表現調控序列之轉殖基因（transgene）的表現功能；SI-PMEC 細胞也可被用來建構一生產外源重組蛋白質的生物反應系統，該產物應會經過轉譯後的修飾作用，因此可保有原本蛋白質的結構與功能。據此，本計畫主旨為利用乳腺上皮細胞建構一可合成與分泌醫藥用重組蛋白質之類乳腺組織生物反應系統，在此三年期計畫中包括三項研究主軸，其分別為 (1) 篩選一在膠原蛋白基質上具分化功能的乳腺上皮細胞株，(2) 由山羊β-酪蛋白（casein）基因調控序列構築而成的表現載體；(3) 建立一中空纖維束生物反應系統（hollow fiber reactor）。研究策略一：馴化、篩選一遺傳穩定而生長快速的乳腺上皮細胞株，此株細胞對動物血清與荷爾蒙的需求性降低，增殖時間不應超過24 小時。同時此細胞株在膠原蛋白基質上仍具有可分化成能合成與分泌乳蛋白質功能的類乳腺組織結構之性質。研究策略二：構築一系列在乳腺與乳腺上皮細胞中可被誘發高表現的載體，其表現調控序列為山羊β-casein 基因。在這些表現載體的基因選殖位置的5』端是一約5 . 6 kb DNA 片段，它包括β-casein 基因起動子、exon 1、intron 1 及部分exon 2 等序列； 3』端是一約3 . 4 kb DNA 片段，它為β-casein 基因exon 7 往後延伸的序列。綠色螢光蛋白（green fluorescent protein）和螢光素.（luciferase）報導基因將被構築於上述表現載體中，以用於測試SI-PMEC 細胞和生物反應器的功能。利用這些表現載體，我們也將構築可表現人類抗菌勝.cathelicidin LL-37 與豬cathelicidin PR-39 之transgenes，此將用以轉染SI-PMEC 細胞以建立可高表現LL-37 和PR-39 的重組 SI-PMEC 細胞株（recombinant SI-PMEC; rSI-PMEC）。研究策略三：rSI-PMEC 細胞將被植入中空纖維束生物反應器之柱狀管內的中空纖維束外腔（extracapillary space; ECS），並供以生長培養基，細胞以貼附方式生長直到高緻密度（confluence）時，置換成分化培養基，此時細胞應在ECS 中形成類乳腺組織狀的網絡三維結構，並持續合成與分泌重組蛋白質，這些蛋白質產物將被濾過、釋放入反應器中空纖維束內（intracapillary space; ICS），並於ICS 循環流動的化學培養液中被逐漸濃縮。本研究的目標是可長期（至少42 天）將rSI-PMEC 細胞培養於中空纖維束生物反應系統中，並能持續高效率生產抗菌勝.cathelicidin LL-37 and PR-39。此外，本計畫所建立的SI-PMEC、表現載體及中空纖維束生物反應器模式皆可被利用於生產其他生技藥物製品。
利用乳腺上皮細胞建構一可合成與分泌醫藥用重組蛋白質之類乳腺組織生物反應系統
(2009)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系(所)
我們已由泌乳母猪乳腺組織中分離出一自發可持續繼代生長的乳腺上皮細胞株，此稱為SI-PMEC（spontaneously immortalized porcine mammary epithelial cells），培養在適當基質的SI-PMEC 細胞於泌乳激素刺激下，可分化形成類乳腺組織形態，即形成具泌乳功能性的乳腺泡、腺管及腺側芽等結構，並大量表現、合成及分泌乳蛋白質。SI-PMEC 細胞可被用來測試將應用於基因轉殖泌乳動物，構築有乳腺專一表現調控序列之轉殖基因（transgene）的表現功能；SI-PMEC 細胞也可被用來建構一生產外源重組蛋白質的生物反應系統，該產物應會經過轉譯後的修飾作用，因此可保有原本蛋白質的結構與功能。據此，本計畫主旨為利用乳腺上皮細胞建構一可合成與分泌醫藥用重組蛋白質之類乳腺組織生物反應系統，在此三年期計畫中包括三項研究主軸，其分別為 (1) 篩選一在膠原蛋白基質上具分化功能的乳腺上皮細胞株，(2) 由山羊 β-酪蛋白（casein）基因調控序列構築而成的表現載體；(3) 建立一中空纖維束生物反應系統（hollow fiber reactor）。研究策略一：馴化、篩選一遺傳穩定而生長快速的乳腺上皮細胞株，此株細胞對動物血清與荷爾蒙的需求性降低，增殖時間不應超過24 小時。同時此細胞株在膠原蛋白基質上仍具有可分化成能合成與分泌乳蛋白質功能的類乳腺組織結構之性質。研究策略二：構築一系列在乳腺與乳腺上皮細胞中可被誘發高表現的載體，其表現調控序列為山羊 β-casein 基因。在這些表現載體的基因選殖位置的5’端是一約5 ∼ 6 kb DNA 片段，它包括 β-casein 基因起動子、exon 1、intron 1 及部分exon 2 等序列； 3’端是一約3 ∼ 4 kb DNA 片段，它為 β-casein 基因exon 7 往後延伸的序列。綠色螢光蛋白（green fluorescent protein）和螢光素酶（luciferase）報導基因將被構築於上述表現載體中，以用於測試SI-PMEC 細胞和生物反應器的功能。利用這些表現載體，我們也將構築可表現人類抗菌胜肽cathelicidin LL-37 與猪cathelicidin PR-39 之transgenes，此將用以轉染SI-PMEC 細胞以建立可高表現LL-37 和PR-39 的重組 SI-PMEC 細胞株（recombinant SI-PMEC; rSI-PMEC）。研究策略三：rSI-PMEC 細胞將被植入中空纖維束生物反應器之柱狀管內的中空纖維束外腔（extracapillary space; ECS），並供以生長培養基，細胞以貼附方式生長直到高緻密度（confluence）時，置換成分化培養基，此時細胞應在ECS 中形成類乳腺組織狀的網絡三維結構，並持續合成與分泌重組蛋白質，這些蛋白質產物將被濾過、釋放入反應器中空纖維束內（intracapillary space; ICS），並於ICS 循環流動的化學培養液中被逐漸濃縮。本研究的目標是可長期（至少42 天）將rSI-PMEC 細胞培養於中空纖維束生物反應系統中，並能持續高效率生產抗菌胜肽cathelicidin LL-37 and PR-39。此外，本計畫所建立的SI-PMEC、表現載體及中空纖維束生物反應器模式皆可被利用於生產其他生技藥物製品。
利用實驗小鼠模式探討血管收縮素轉化?(ACE2) 表現調節與肺纖維化有關之分子機轉
(2012)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系（所）
肺纖維化是一項慢性和複雜的疾病，可由多種原因導致，但大部分患者之病因不明，臨床上稱之為原發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis; IPF）。雖然在腎素-血管收縮素系統中（renin-angiotensin system; RAS），已知血管收縮素轉化酶（angiotensin-converting enzyme; ACE）/ 血管收縮素II（angiotensin II; Ang II）途徑（ACE/Ang II axis）與許多肺部疾病有關，但在RAS 系統中的另一個ACE 類似酵素，血管收縮素轉化酶II （angiotensin-converting enzyme II; ACE2）卻鮮少被探討，其在包括IPF 的一些肺部疾病中的病理生理機轉仍有許多未知。在 RAS 中，ACE2 可將Ang II 轉化成血管收縮素1-7（angiotensin 1-7; Ang-(1-7)），而Ang-(1-7) 被認為有拮抗Ang II 的生理功能。在我們過去的研究結果中顯示，ACE2/Ang-(1-7) axis 的異常與心臟組織纖維化病程有關，而此可能經由基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases; MMPs）與基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of MMPs; TIMPs）的調控失衡有關。在本計畫中，我們將探討肺部 ACE2 表現調節因子與肺纖維化病程有關之分子機轉，以及MMPs/TIMPs 平衡調控與肺臟組織纖維化的關係。在本計畫中，我們針對上述的議題，擬訂五個研究目標：(1) 瞭解肺臟組織中ACE2 表現之特定細胞，探討ACE2 基因表現的調節因子，以及一些與肺纖維化病變有關之誘發因子（包括bleomycin、TGF-1、Ang II 及Ang-(1-7)）對於肺組織中特定細胞的ACE2 表現之影響；(2) 建立肺纖維化實驗小鼠研究模式，利用ACE2 基因剔除（ACE2-/y）實驗小鼠與ACE2 活性控制，探討ACE2 在肺纖維化病程中扮演的角色； (3) 探討在肺纖維化病程中，MMPs 和TIMPs 的表現與活化態樣，並研究這些MMPs/TIMPs 的表現調節與ACE2 的相關性；(4) 探討特定MMPs/TIMPs 的活化劑（activator）和抑制劑（inhibitor）對於進行中之肺纖維化病程的影響；(5) 篩選調節ACE2 表現可能存在之 microRNAs，印證此特定microRNAs 的表現與抑制是否影響肺纖維化之病程，為肺纖維化病程控制帶來新藥物開發之契機。由於目前 IPF 在臨床上尚無明確有效性的用藥，因此急需開發更有效率的治療藥物，而我們的研究將有助於研究者更了解ACE2 表現調節與MMPs/TIMPs 的平衡調控在IPF 病程演進中所扮演的角色，也提供IPF 在預防或治療上具開發潛能之新標的。
利用實驗小鼠模式探討血管收縮素轉化?(ACE2) 表現調節與肺纖維化有關之分子機轉
(2013)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系（所）
肺纖維化是一項慢性和複雜的疾病，可由多種原因導致，但大部分患者之病因不明，臨床上稱之為原發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis; IPF）。雖然在腎素-血管收縮素系統中（renin-angiotensin system; RAS），已知血管收縮素轉化酶（angiotensin-converting enzyme; ACE）/ 血管收縮素II（angiotensin II; Ang II）途徑（ACE/Ang II axis）與許多肺部疾病有關，但在RAS 系統中的另一個ACE 類似酵素，血管收縮素轉化酶II （angiotensin-converting enzyme II; ACE2）卻鮮少被探討，其在包括IPF 的一些肺部疾病中的病理生理機轉仍有許多未知。在 RAS 中，ACE2 可將Ang II 轉化成血管收縮素1-7（angiotensin 1-7; Ang-(1-7)），而Ang-(1-7) 被認為有拮抗Ang II 的生理功能。在我們過去的研究結果中顯示，ACE2/Ang-(1-7) axis 的異常與心臟組織纖維化病程有關，而此可能經由基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases; MMPs）與基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of MMPs; TIMPs）的調控失衡有關。在本計畫中，我們將探討肺部 ACE2 表現調節因子與肺纖維化病程有關之分子機轉，以及MMPs/TIMPs 平衡調控與肺臟組織纖維化的關係。在本計畫中，我們針對上述的議題，擬訂五個研究目標：(1) 瞭解肺臟組織中ACE2 表現之特定細胞，探討ACE2 基因表現的調節因子，以及一些與肺纖維化病變有關之誘發因子（包括bleomycin、TGF-1、Ang II 及Ang-(1-7)）對於肺組織中特定細胞的ACE2 表現之影響；(2) 建立肺纖維化實驗小鼠研究模式，利用ACE2 基因剔除（ACE2-/y）實驗小鼠與ACE2 活性控制，探討ACE2 在肺纖維化病程中扮演的角色； (3) 探討在肺纖維化病程中，MMPs 和TIMPs 的表現與活化態樣，並研究這些MMPs/TIMPs 的表現調節與ACE2 的相關性；(4) 探討特定MMPs/TIMPs 的活化劑（activator）和抑制劑（inhibitor）對於進行中之肺纖維化病程的影響；(5) 篩選調節ACE2 表現可能存在之 microRNAs，印證此特定microRNAs 的表現與抑制是否影響肺纖維化之病程，為肺纖維化病程控制帶來新藥物開發之契機。由於目前 IPF 在臨床上尚無明確有效性的用藥，因此急需開發更有效率的治療藥物，而我們的研究將有助於研究者更了解ACE2 表現調節與MMPs/TIMPs 的平衡調控在IPF 病程演進中所扮演的角色，也提供IPF 在預防或治療上具開發潛能之新標的。
利用實驗小鼠模式探討血管收縮素轉化酶(ACE2) 表現調節與肺纖維化有關之分子機轉
(2014)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系（所）
肺纖維化是一項慢性和複雜的疾病，可由多種原因導致，但大部分患者之病因不明，臨床上稱之為原發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis; IPF）。雖然在腎素-血管收縮素系統中（renin-angiotensin system; RAS），已知血管收縮素轉化酶（angiotensin-converting enzyme; ACE）/ 血管收縮素II（angiotensin II; Ang II）途徑（ACE/Ang II axis）與許多肺部疾病有關，但在RAS 系統中的另一個ACE 類似酵素，血管收縮素轉化酶II （angiotensin-converting enzyme II; ACE2）卻鮮少被探討，其在包括IPF 的一些肺部疾病中的病理生理機轉仍有許多未知。在 RAS 中，ACE2 可將Ang II 轉化成血管收縮素1-7（angiotensin 1-7; Ang-(1-7)），而Ang-(1-7) 被認為有拮抗Ang II 的生理功能。在我們過去的研究結果中顯示，ACE2/Ang-(1-7) axis 的異常與心臟組織纖維化病程有關，而此可能經由基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases; MMPs）與基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of MMPs; TIMPs）的調控失衡有關。在本計畫中，我們將探討肺部 ACE2 表現調節因子與肺纖維化病程有關之分子機轉，以及MMPs/TIMPs 平衡調控與肺臟組織纖維化的關係。在本計畫中，我們針對上述的議題，擬訂五個研究目標：(1) 瞭解肺臟組織中ACE2 表現之特定細胞，探討ACE2 基因表現的調節因子，以及一些與肺纖維化病變有關之誘發因子（包括bleomycin、TGF-1、Ang II 及Ang-(1-7)）對於肺組織中特定細胞的ACE2 表現之影響；(2) 建立肺纖維化實驗小鼠研究模式，利用ACE2 基因剔除（ACE2-/y）實驗小鼠與ACE2 活性控制，探討ACE2 在肺纖維化病程中扮演的角色； (3) 探討在肺纖維化病程中，MMPs 和TIMPs 的表現與活化態樣，並研究這些MMPs/TIMPs 的表現調節與ACE2 的相關性；(4) 探討特定MMPs/TIMPs 的活化劑（activator）和抑制劑（inhibitor）對於進行中之肺纖維化病程的影響；(5) 篩選調節ACE2 表現可能存在之 microRNAs，印證此特定microRNAs 的表現與抑制是否影響肺纖維化之病程，為肺纖維化病程控制帶來新藥物開發之契機。由於目前 IPF 在臨床上尚無明確有效性的用藥，因此急需開發更有效率的治療藥物，而我們的研究將有助於研究者更了解ACE2 表現調節與MMPs/TIMPs 的平衡調控在IPF 病程演進中所扮演的角色，也提供IPF 在預防或治療上具開發潛能之新標的。
基質金屬蛋白脢(MMPs)與金屬蛋白脢組織抑制因子(TIMPs)的表現調節與活化之交互關聯性及其在左心室重塑病程中的病理機制
(2007)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系(所)
心肌梗塞（myocardial infarction; MI）後發生的左心室重塑（left ventricular remodeling; LV remodeling）病程將導致患者心臟衰竭（heart failure; HF），甚至死亡。近二十年來，研究者已知細胞間基質（extracellular matrix; ECM）的失序是LV remodeling 病理機轉中的一個重要因素。基質金屬蛋白.（Matrix metalloproteinases; MMPs）是一群可降解組織中ECM 的蛋白質分解酵素，而不正常ECM 的降解與許多疾病的病理生理狀況有關。此外，組織中存在一類內源性金屬蛋白.組織抑制因子（ tissue inhibitors of metalloproteinases; TIMPs），它們精密調控著MMPs 的活性。因此，一旦體內發生MMP 與TIMP 基因表現或酵素活化水平上的調控失衡，將導致組織中MMP 活性異常提昇，就會誘發MI 傷害、HF 及擴張性心肌病（dilated cardiomyopathy; DCM）等等。儘管影響ECM 的正常代謝與疾病發生關係密切，但是MMPs、TIMPs 及其調節因子間的交互作用與在MI 或HF 病程的發生機制至今仍存在許多疑團，等待探索。在本計畫中，我們針對解決上述疑團，擬訂三個研究策略。研究策略一，我們將構築MMP/TIMP .promoter activity 的載體（ vector ），包括MMP-2/TIMP-2 與 MMP-9/TIMP-4 兩個載體，其分別將在MMP 與TIMP 基因起動子（promoter，約1.5 ~ 2 kb 長度）後端聯接報導基因（reportor）綠色螢光蛋白（green fluorescent protein; GFP）與紅色螢光蛋白（red fluorescent protein; dsRed）。所建構的載體將利用DNA-微脂粒（liposome）方法傳送入培養的心臟成纖維母細胞（myofibroblast）株H9c2 或由大鼠初代培養的心臟成纖維母細胞中，用於探討在TGF-β、TNF-α、angiotensin peptides 或 hypoxia 處理下，細胞中MMP 與TIMP 基因被調節表現的交互相關性，而這些都是已知會影響細胞啟動與ECM 代謝有關的訊號傳遞途徑（signaling pathways）的因子。研究策略二，建構一ECM、MMPs、TIMPs、與其相關基因之寡核.酸（oligonucleotide，65 ~ 70 mer）的基因晶片CardioMP Gene Chip，此晶片將用於經TGF-β、TNF-α、angiotensin peptides 或hypoxia 處理之細胞（研究策略一），及MI 或衰竭心臟組織中ECM、MMPs、 TIMPs 及其相關基因表現的全貌與態樣（研究策略三）。CardioMP Gene Chip 將採用Cy3 與Cy5 .螢光競爭性雜交（competitive hybridization）的玻璃晶片系統行之。研究策略三，我們將建立冠狀動脈結紮（coronary artery ligation; CAL）與注射adriamycin 方法誘發大鼠MI 或HF 的動物模式，此將提供我們探討在LV remodeling 病程中心臟ECM、 MMPs、TIMPs 及其相關因子的交互影響網絡。大鼠在接受CAL 手術或密集注射 adriamycin 後的不同時間點，我們將利用zymography 方法測定大鼠血漿中與心臟組織中各種MMPs 與TIMPs 活性，也將利用CardioMP Gene Chip 分析其心臟組織中各基因表現的態樣。 ECM 的代謝是一個發生在細胞與細胞間的精密且動態地調節過程，MMP/TIMP 間的平衡狀況一旦受到破壞，ECM 代謝調節就會失序，這是許多心血管主要的病理機轉與病變特癥。據此，我們的研究將有助於研究者更瞭解此複雜心血管疾病（特別是HF）的致病機轉，除對心血管疾病的發病機制有進一步認識外，進而能研發出新穎且有效性的MMPs 抑製藥物或方法。
基質金屬蛋白脢(MMPs)與金屬蛋白脢組織抑制因子(TIMPs)的表現調節與活化之交互關聯性及其在左心室重塑病程中的病理機制
(2008)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系(所)
心肌梗塞（myocardial infarction; MI）後發生的左心室重塑（left ventricular remodeling; LV remodeling）病程將導致患者心臟衰竭（heart failure; HF），甚至死亡。近二十年來，研究者已知細胞間基質（extracellular matrix; ECM）的失序是LV remodeling 病理機轉中的一個重要因素。基質金屬蛋白.（Matrix metalloproteinases; MMPs）是一群可降解組織中ECM 的蛋白質分解酵素，而不正常ECM 的降解與許多疾病的病理生理狀況有關。此外，組織中存在一類內源性金屬蛋白.組織抑制因子（ tissue inhibitors of metalloproteinases; TIMPs），它們精密調控著MMPs 的活性。因此，一旦體內發生MMP 與TIMP 基因表現或酵素活化水平上的調控失衡，將導致組織中MMP 活性異常提昇，就會誘發MI 傷害、HF 及擴張性心肌病（dilated cardiomyopathy; DCM）等等。儘管影響ECM 的正常代謝與疾病發生關係密切，但是MMPs、TIMPs 及其調節因子間的交互作用與在MI 或HF 病程的發生機制至今仍存在許多疑團，等待探索。在本計畫中，我們針對解決上述疑團，擬訂三個研究策略。研究策略一，我們將構築MMP/TIMP .promoter activity 的載體（ vector ），包括MMP-2/TIMP-2 與 MMP-9/TIMP-4 兩個載體，其分別將在MMP 與TIMP 基因起動子（promoter，約1.5 ~ 2 kb 長度）後端聯接報導基因（reportor）綠色螢光蛋白（green fluorescent protein; GFP）與紅色螢光蛋白（red fluorescent protein; dsRed）。所建構的載體將利用DNA-微脂粒（liposome）方法傳送入培養的心臟成纖維母細胞（myofibroblast）株H9c2 或由大鼠初代培養的心臟成纖維母細胞中，用於探討在TGF-β、TNF-α、angiotensin peptides 或 hypoxia 處理下，細胞中MMP 與TIMP 基因被調節表現的交互相關性，而這些都是已知會影響細胞啟動與ECM 代謝有關的訊號傳遞途徑（signaling pathways）的因子。研究策略二，建構一ECM、MMPs、TIMPs、與其相關基因之寡核.酸（oligonucleotide，65 ~ 70 mer）的基因晶片CardioMP Gene Chip，此晶片將用於經TGF-β、TNF-α、angiotensin peptides 或hypoxia 處理之細胞（研究策略一），及MI 或衰竭心臟組織中ECM、MMPs、 TIMPs 及其相關基因表現的全貌與態樣（研究策略三）。CardioMP Gene Chip 將採用Cy3 與Cy5 .螢光競爭性雜交（competitive hybridization）的玻璃晶片系統行之。研究策略三，我們將建立冠狀動脈結紮（coronary artery ligation; CAL）與注射adriamycin 方法誘發大鼠MI 或HF 的動物模式，此將提供我們探討在LV remodeling 病程中心臟ECM、 MMPs、TIMPs 及其相關因子的交互影響網絡。大鼠在接受CAL 手術或密集注射 adriamycin 後的不同時間點，我們將利用zymography 方法測定大鼠血漿中與心臟組織中各種MMPs 與TIMPs 活性，也將利用CardioMP Gene Chip 分析其心臟組織中各基因表現的態樣。 ECM 的代謝是一個發生在細胞與細胞間的精密且動態地調節過程，MMP/TIMP 間的平衡狀況一旦受到破壞，ECM 代謝調節就會失序，這是許多心血管主要的病理機轉與病變特癥。據此，我們的研究將有助於研究者更瞭解此複雜心血管疾病（特別是HF）的致病機轉，除對心血管疾病的發病機制有進一步認識外，進而能研發出新穎且有效性的MMPs 抑製藥物或方法。
血管收縮素轉化？？II–血管收縮素1-7途徑 (ACE2–Ang 1-7 axis) 在心臟衰竭病程演進中扮演角色的探討
(2011)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系（所）
血管收縮素轉化脢II-血管收縮素1-7途徑 (ACE2-Ang 1-7 Axis) 在心臟衰竭病程演進中扮演角色的探討
(2009)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系(所)
血管收縮素轉化脢II-血管收縮素1-7途徑 (ACE2-Ang1-7 axis) 在心臟衰竭病程演進中扮演角色的探討
(2010)
林志生
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LIN CHIH SHENG
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國立交通大學生物科技學系（所）