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Browsing by Author "Li Yaw-Kuen"

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    Borate moiety-contained linker and bio-sensing element containing the same
    (2015-01-13)
    Li Yaw-Kuen
    ;
    Shen Mo-Yuan
    ;
    Pien Yu-Ju
    A borate moiety-contained linker and a bio-sensing element containing the same are disclosed. The borate moiety-contained linker can be used to modify a sensing molecule and connect the sensing molecule to a substrate to form the bio-sensing element.
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    Vectors, methods, systems and kits for protein purification
    (2012-08-07)
    Li Yaw-Kuen
    ;
    Wu Yue-Jin
    Disclosed herein are autocleaved peptide linkers for producing purified proteins. The autocleaved peptide linkers are inserted between a chitin binding protein (CBP) and a target protein to form a fusion protein. Upon expression of the fusion protein, it is allowed to pass a chitin matrix so that the CBP portion of the fusion protein may be bound with the chitin matrix, the peptide linker then undergoes auto-cleavage in a buffer solution at a pH value of about 5.5-7.5 to release the target protein. The chitin matrix may be regenerated with another buffer solution at a pH value of about 3-4, that is, to release the bound CBP and return to its unbound form. The chitin matrix may be reused for at least 6 times without losing its function.
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    Vectors, Methods, Systems and Kits for Protein Purification
    (2011-06-23)
    Li Yaw-Kuen
    ;
    Wu Yue-Jin
    Disclosed herein are autocleaved peptide linkers for producing purified proteins. The autocleaved peptide linkers are inserted between a chitin binding protein (CBP) and a target protein to form a fusion protein. Upon expression of the fusion protein, it is allowed to pass a chitin matrix so that the CBP portion of the fusion protein may be bound with the chitin matrix, the peptide linker then undergoes auto-cleavage in a buffer solution at a pH value of about 5.5-7.5 to release the target protein. The chitin matrix may be regenerated with another buffer solution at a pH value of about 3-4, that is, to release the bound CBP and return to its unbound form. The chitin matrix may be reused for at least 6 times without losing its function.
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    人類 alpha-L-岩藻醣甘酵素之結構與催化機構的研究(II)
    (2006)
    李耀坤
    ;
    Li Yaw-Kuen
    ;
    交通大學應用化學系
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    人類透明質酸水解脢和其抑制劑之研究開發
    (2009)
    李耀坤
    ;
    Li Yaw-Kuen
    ;
    國立交通大學應用化學系(所)
    Hyaluronidase(Hyal)已被廣泛地應用在醫療上，但醫藥級Hyal 的供應卻時常短缺。 因此，如何獲得人類重組Hyal (recombinant human Hyal)已然成為一個重要且具價值的課 題。已有證據顯示Hyal 可能有抗癌的效應並且能抑制腫瘤轉移，不過，目前的結論卻 相當不一致。例如Hyal-1 和Hyal-2 在不同的腫瘤裡的具體功能似乎互相矛盾，且尚無 法解釋其究理。所以，更進一步研究hyaluronidase 酵素活性與其對生理的影響，甚或是 開發具選擇專一性和較強抑制能力的抑制劑，都是目前急迫的議題。此外，Hyal 抑制劑 除了可當作治療arthroses 的醫藥物使用外，亦可結合抗生素，用在抗細菌治療上，特別 是對可生產hyaluronate lyase 的細菌。雖然肝素 (heparin)、黃酮類化合物 (flavonoids) 和 全磺化(fully O-sulfonated)之glycosaminoglycans 已被發現在試管試驗中(in vitro) 可抑制 牛睪丸之hyaluronidase (BTH) 活性。但是這些化合物僅具有微弱的抑製作用，所以到目 前為止，並沒有較具潛力或選擇性較高的抑制劑被發現。L-ascorbic acid 6-hexadecanoate (Vcpal)是近年來被發現對BTH 具有有較佳的抑制效果的化合物，其IC50 為56 μM。我 們因此計畫使用Vcpal 作為本研究之內標的物(「threshold」 compound)，透過competitive binding technique 篩選出對哺乳動物Hyals 作用較強的抑制劑。這種competitive binding technique 技術的發展將結合螢光共振能轉移技術(FRET)。本研究亦將開發以FRET 技術 進行準確的酵素動力分析。此外，依據蜜蜂毒液中hyaluronidase 與HA 的四單元醣 (tetrasaccharide)碎片的蛋白質晶體結構，人類Hyal 的相似模組(homology models)可以利 用電腦模擬技術預測出來。這些蛋白模組將被實際應用於Hyal 抑制劑的篩選上。 計畫案將於三年內執行，具體的主題包括︰ 第1-第2 年 (1) 人類 Hyal-1 和Hyal-2 的基因重組和蛋白質表達 (2) 發展一種有效的方法分析 Hyal 的酵素活性 (3) 發展一以 FRET 為基礎、篩選Hyal 抑制劑的平台 (4) 電腦模擬(structure simulation)人類Hyal-1 和Hyal-2 的蛋白質結構 (5) 合成玻尿酸衍生物作為 FRET 酵素分析的基質(substrate) (6) 合成 Vcpal 的衍生物作為抑制劑的標的 第2-第3 年 (1) 篩選 Hyal 抑制劑 (2) 對篩選出的藥物做抑制效應的定量評估 (3) 用化學修飾法增進抑制劑的抑制效果 (4) Hyals 的酵素特性分析和基因突變的研究 (5) 哺乳動物 Hyals 的酵素動力與催化機制的探討
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    人類透明質酸水解脢和其抑制劑之研究開發
    (2007)
    李耀坤
    ;
    Li Yaw-Kuen
    ;
    國立交通大學應用化學系(所)
    Hyaluronidase(Hyal)已被廣泛地應用在醫療上，但醫藥級Hyal 的供應卻時常短缺。 因此，如何獲得人類重組Hyal (recombinant human Hyal)已然成為一個重要且具價值的課 題。已有證據顯示Hyal 可能有抗癌的效應並且能抑制腫瘤轉移，不過，目前的結論卻 相當不一致。例如Hyal-1 和Hyal-2 在不同的腫瘤裡的具體功能似乎互相矛盾，且尚無 法解釋其究理。所以，更進一步研究hyaluronidase 酵素活性與其對生理的影響，甚或是 開發具選擇專一性和較強抑制能力的抑制劑，都是目前急迫的議題。此外，Hyal 抑制劑 除了可當作治療arthroses 的醫藥物使用外，亦可結合抗生素，用在抗細菌治療上，特別 是對可生產hyaluronate lyase 的細菌。雖然肝素 (heparin)、黃酮類化合物 (flavonoids) 和 全磺化(fully O-sulfonated)之glycosaminoglycans 已被發現在試管試驗中(in vitro) 可抑制 牛睪丸之hyaluronidase (BTH) 活性。但是這些化合物僅具有微弱的抑製作用，所以到目 前為止，並沒有較具潛力或選擇性較高的抑制劑被發現。L-ascorbic acid 6-hexadecanoate (Vcpal)是近年來被發現對BTH 具有有較佳的抑制效果的化合物，其IC50 為56 μM。我 們因此計畫使用Vcpal 作為本研究之內標的物(「threshold」 compound)，透過competitive binding technique 篩選出對哺乳動物Hyals 作用較強的抑制劑。這種competitive binding technique 技術的發展將結合螢光共振能轉移技術(FRET)。本研究亦將開發以FRET 技術 進行準確的酵素動力分析。此外，依據蜜蜂毒液中hyaluronidase 與HA 的四單元醣 (tetrasaccharide)碎片的蛋白質晶體結構，人類Hyal 的相似模組(homology models)可以利 用電腦模擬技術預測出來。這些蛋白模組將被實際應用於Hyal 抑制劑的篩選上。 計畫案將於三年內執行，具體的主題包括︰ 第1-第2 年 (1) 人類Hyal-1 和Hyal-2 的基因重組和蛋白質表達 (2) 發展一種有效的方法分析Hyal 的酵素活性 (3) 發展一以 FRET 為基礎、篩選Hyal 抑制劑的平台 (4) 電腦模擬(structure simulation)人類Hyal-1 和Hyal-2 的蛋白質結構 (5) 合成玻尿酸衍生物作為FRET 酵素分析的基質(substrate) (6) 合成Vcpal 的衍生物作為抑制劑的標的 第2-第3 年 (1) 篩選Hyal 抑制劑 (2) 對篩選出的藥物做抑制效應的定量評估 (3) 用化學修飾法增進抑制劑的抑制效果 (4) Hyals 的酵素特性分析和基因突變的研究 (5) 哺乳動物Hyals 的酵素動力與催化機制的探討。
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    人類透明質酸水解脢和其抑制劑之研究開發
    (2008)
    李耀坤
    ;
    Li Yaw-Kuen
    ;
    國立交通大學應用化學系(所)
    Hyaluronidase(Hyal)已被廣泛地應用在醫療上，但醫藥級Hyal 的供應卻時常短缺。 因此，如何獲得人類重組Hyal (recombinant human Hyal)已然成為一個重要且具價值的課 題。已有證據顯示Hyal 可能有抗癌的效應並且能抑制腫瘤轉移，不過，目前的結論卻 相當不一致。例如Hyal-1 和Hyal-2 在不同的腫瘤裡的具體功能似乎互相矛盾，且尚無 法解釋其究理。所以，更進一步研究hyaluronidase 酵素活性與其對生理的影響，甚或是 開發具選擇專一性和較強抑制能力的抑制劑，都是目前急迫的議題。此外，Hyal 抑制劑 除了可當作治療arthroses 的醫藥物使用外，亦可結合抗生素，用在抗細菌治療上，特別 是對可生產hyaluronate lyase 的細菌。雖然肝素 (heparin)、黃酮類化合物 (flavonoids) 和 全磺化(fully O-sulfonated)之glycosaminoglycans 已被發現在試管試驗中(in vitro) 可抑制 牛睪丸之hyaluronidase (BTH) 活性。但是這些化合物僅具有微弱的抑製作用，所以到目 前為止，並沒有較具潛力或選擇性較高的抑制劑被發現。L-ascorbic acid 6-hexadecanoate (Vcpal)是近年來被發現對BTH 具有有較佳的抑制效果的化合物，其IC50 為56 μM。我 們因此計畫使用Vcpal 作為本研究之內標的物(「threshold」 compound)，透過competitive binding technique 篩選出對哺乳動物Hyals 作用較強的抑制劑。這種competitive binding technique 技術的發展將結合螢光共振能轉移技術(FRET)。本研究亦將開發以FRET 技術 進行準確的酵素動力分析。此外，依據蜜蜂毒液中hyaluronidase 與HA 的四單元醣 (tetrasaccharide)碎片的蛋白質晶體結構，人類Hyal 的相似模組(homology models)可以利 用電腦模擬技術預測出來。這些蛋白模組將被實際應用於Hyal 抑制劑的篩選上。 計畫案將於三年內執行，具體的主題包括︰ 第1-第2 年 (1) 人類 Hyal-1 和Hyal-2 的基因重組和蛋白質表達 (2) 發展一種有效的方法分析 Hyal 的酵素活性 (3) 發展一以 FRET 為基礎、篩選Hyal 抑制劑的平台 (4) 電腦模擬(structure simulation)人類Hyal-1 和Hyal-2 的蛋白質結構 (5) 合成玻尿酸衍生物作為 FRET 酵素分析的基質(substrate) (6) 合成 Vcpal 的衍生物作為抑制劑的標的 第2-第3 年 (1) 篩選 Hyal 抑制劑 (2) 對篩選出的藥物做抑制效應的定量評估 (3) 用化學修飾法增進抑制劑的抑制效果 (4) Hyals 的酵素特性分析和基因突變的研究 (5) 哺乳動物 Hyals 的酵素動力與催化機制的探討
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    化學學門(有機組與無機組)研究發展及推動計畫
    (2012)
    李耀坤
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    Li Yaw-Kuen
    ;
    國立交通大學應用化學系（所）
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    化學學門(有機組與無機組)研究發展及推動計畫
    (2013)
    李耀坤
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    Li Yaw-Kuen
    ;
    國立交通大學應用化學系（所）
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    化學學門(有機組與無機組)研究發展及推動計畫
    (2011)
    李耀坤
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    Li Yaw-Kuen
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    國立交通大學應用化學系（所）
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    多牙苯硼酸衍生物之設計、合成與生物科技應用( I )
    (2015)
    李耀坤
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    Li Yaw-Kuen
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    國立交通大學應用化學系（所）
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    研究能自發斷裂之胜？並應用於提高蛋白質純化之效能
    (2011)
    李耀坤
    ;
    Li Yaw-Kuen
    ;
    國立交通大學應用化學系（所）
    蛋白質純化一般涉及多個與管柱層析有關的操作，例如離子交換、疏水性交互作用和凝 膠過濾等。純化蛋白質的最佳方式是利用與具有特定官能基之凝膠進行親和性結合來達 到分離及純化的目的，這類具有特定官能基的凝膠管柱層析法包括，例如，鎳管柱層析、 榖胱氨肽改質之管柱層析、麥芽糖改質之凝膠管柱層析或其他等等。但是，目前盛行的 這類蛋白質管柱層析法尚有許多缺陷有待克服，例如，通常所獲得的是一種融合蛋白， 因此後續會需要用到蛋白酶來去除不要的融合部位，或是需要用到可進行親和性結合但 價格高昂的凝膠。有鑑於此，相關領域亟需提出一種可用來產生純化蛋白質且不需用到 蛋白酶處理之改良的方法和/或系統，此種改良的方法和/或系統本身易於使用、具經濟 效益且可在不犧牲標的蛋白本身功能的情況下，用來大量生產出純化的標的蛋白質。 本實驗室最近建構一含有幾丁質結合蛋白質(CBP)和(EAAAK)5 胜肽連接子的表現系 統，並意外發現經幾丁質管柱純化所得之融合蛋白上，其(EAAAK)5 胜肽連接子有自發 斷裂的特性。此系統可利用廉價幾丁質管柱且不需使用蛋白酶即可得重組之目標蛋白， 極適合發展量產高階蛋白之應用。然而此系統仍存在許多學理與技術應用待進一步研究: 1. 如何加強並操控胜肽連接子自我斷裂之速度 2. 如何最適化CBP 與幾丁質於不同pH 下之結合力 3. 如何克服產生涵胞體(inclusion body)的問題 4. 驗證CBP/auto-cleavage-linker 載體於其他表現系統，如Pichia pastoris 表現系統之可 行性。 為研究上述問題，我們將針對一系列可形成α-helix 結構之重複性五胜肽，如(EAAAK)5, (EAAAR)5, (EGGGK)5, 和 (EGGGR)5 等進行胜肽和蛋白質層級之自發斷裂研究。將應 用基因改質技術局部調整CBP 與幾丁質結合區的結構，並研究其突變後之結合力。為 克服重組蛋白之溶解度(或形成涵胞體)之問題，我們將於新建之載體上引入大腸桿菌一 periplasmic 蛋白osmY，osmY 最近被發現可有效將與其融合之蛋白攜出大腸桿菌外。利 用此載體可望將許多溶解度不佳之人體蛋白質直接表現於胞外，並結合幾丁質管柱和胜 肽連接子自發斷裂的特性純化此等蛋白質。本計畫將先鎖定人體金屬蛋白酵素13 和15 (matrix metalloproteinase 13 和15)之表現，其他如轉醣酵素亦可嚐試。成功大量表現此 等酵素將對許多疾病之研究有重大幫助。此外，我們亦將應用這類型表現載體於它種表 現系統中，如Pichia pastoris。 本計畫預計執行三年，年度工作大項如: 第一和第二年 1. 研究(EAAAK)5、(EAAAR)5、(EGGGK)5和(EGGGR)5胜肽之自發斷裂化學反應機構 2. 建構含有(EAAAK)5、(EAAAR)5、(EGGGK)5和(EGGGR)5胜肽連接子與CBP之各式表 現載體 3. 研究含各種胜肽連接子之融合蛋白質的自發斷裂性質和斷裂速度之操控 4. 以蛋白質基因工程改進CBP 對幾丁質之親和力 5. 應用和評估此類新穎表現載體於大量蛋白質純化之可行性 第二和第三年 The second year – the third year 1. osmY之基因選植 2. 重建含osmY、CBP、自發斷裂胜肽連接子之表現載體 (命名為pOsCL載體) 3. 應用新式表現載體製備和純化MMP13 和 MMP15，並研究攜出蛋白之自發斷裂性質 4. MMP13 和 MMP15 之活性分析 5. 含有自發斷裂胜肽連接子之新式表現載體於 Pichia pastoris 表現系統的功能
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    研究能自發斷裂之胜太並應用於提高蛋白質純化之效能
    (2010)
    李耀坤
    ;
    Li Yaw-Kuen
    ;
    國立交通大學應用化學系（所）
    蛋白質純化一般涉及多個與管柱層析有關的操作，例如離子交換、疏水性交互作用和凝 膠過濾等。純化蛋白質的最佳方式是利用與具有特定官能基之凝膠進行親和性結合來達 到分離及純化的目的，這類具有特定官能基的凝膠管柱層析法包括，例如，鎳管柱層析、 榖胱氨肽改質之管柱層析、麥芽糖改質之凝膠管柱層析或其他等等。但是，目前盛行的 這類蛋白質管柱層析法尚有許多缺陷有待克服，例如，通常所獲得的是一種融合蛋白， 因此後續會需要用到蛋白酶來去除不要的融合部位，或是需要用到可進行親和性結合但 價格高昂的凝膠。有鑑於此，相關領域亟需提出一種可用來產生純化蛋白質且不需用到 蛋白酶處理之改良的方法和/或系統，此種改良的方法和/或系統本身易於使用、具經濟 效益且可在不犧牲標的蛋白本身功能的情況下，用來大量生產出純化的標的蛋白質。 本實驗室最近建構一含有幾丁質結合蛋白質(CBP)和(EAAAK)5 胜肽連接子的表現系 統，並意外發現經幾丁質管柱純化所得之融合蛋白上，其(EAAAK)5 胜肽連接子有自發 斷裂的特性。此系統可利用廉價幾丁質管柱且不需使用蛋白酶即可得重組之目標蛋白， 極適合發展量產高階蛋白之應用。然而此系統仍存在許多學理與技術應用待進一步研究: 1. 如何加強並操控胜肽連接子自我斷裂之速度 2. 如何最適化CBP 與幾丁質於不同pH 下之結合力 3. 如何克服產生涵胞體(inclusion body)的問題 4. 驗證CBP/auto-cleavage-linker 載體於其他表現系統，如Pichia pastoris 表現系統之可 行性。 為研究上述問題，我們將針對一系列可形成α-helix 結構之重複性五胜肽，如(EAAAK)5, (EAAAR)5, (EGGGK)5, 和 (EGGGR)5 等進行胜肽和蛋白質層級之自發斷裂研究。將應 用基因改質技術局部調整CBP 與幾丁質結合區的結構，並研究其突變後之結合力。為 克服重組蛋白之溶解度(或形成涵胞體)之問題，我們將於新建之載體上引入大腸桿菌一 periplasmic 蛋白osmY，osmY 最近被發現可有效將與其融合之蛋白攜出大腸桿菌外。利 用此載體可望將許多溶解度不佳之人體蛋白質直接表現於胞外，並結合幾丁質管柱和胜 肽連接子自發斷裂的特性純化此等蛋白質。本計畫將先鎖定人體金屬蛋白酵素13 和15 (matrix metalloproteinase 13 和15)之表現，其他如轉醣酵素亦可嚐試。成功大量表現此 等酵素將對許多疾病之研究有重大幫助。此外，我們亦將應用這類型表現載體於它種表 現系統中，如Pichia pastoris。 本計畫預計執行三年，年度工作大項如: 第一和第二年 1. 研究(EAAAK)5、(EAAAR)5、(EGGGK)5和(EGGGR)5胜肽之自發斷裂化學反應機構 2. 建構含有(EAAAK)5、(EAAAR)5、(EGGGK)5和(EGGGR)5胜肽連接子與CBP之各式表 現載體 3. 研究含各種胜肽連接子之融合蛋白質的自發斷裂性質和斷裂速度之操控 4. 以蛋白質基因工程改進CBP 對幾丁質之親和力 5. 應用和評估此類新穎表現載體於大量蛋白質純化之可行性 第二和第三年 The second year – the third year 1. osmY之基因選植 2. 重建含osmY、CBP、自發斷裂胜肽連接子之表現載體 (命名為pOsCL載體) 3. 應用新式表現載體製備和純化MMP13 和 MMP15，並研究攜出蛋白之自發斷裂性質 4. MMP13 和 MMP15 之活性分析 5. 含有自發斷裂胜肽連接子之新式表現載體於 Pichia pastoris 表現系統的功能
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    設計並建立以酵素催化合成醣基化黃酮素化合物之平台
    (2014)
    李耀坤
    ;
    Li Yaw-Kuen
    ;
    國立交通大學應用化學系（所）
    醣基化(glycosylation)為生物合成中常見的修飾反應，分子的親疏水性、溶解度、生物活 性及構形等會隨之改變。本計畫的主要目的是以枯草桿菌(Bacillus cereus)的大環內酯醣 基轉移酶(macrolide glycosyltransferases，MGT)為主，配合碗豆的蔗糖合成酶(sucrose synthase，SUS)與其它酵素，建立一個兼具高位向專一性及醣基多樣性的類黃酮醣基衍 生物生產平台。其中我們將以槲皮素為模型，針對MGT 的兩個鍵結區--醣基鍵結區與 受質鍵結區--進行突變改造，增加醣基的選擇性和槲皮素醣基化位向的專一性。除了 MGT 的突變與其表現和純化，我們也將建立一套篩檢不同位向專一醣基化突變株的方 法，期望此平台的建立，能對槲皮素及相關類黃酮類的醣基化有更進一步的了解。 第一年至第二年主要工作項目包括： (1)轉糖酵素的活性和產物分析方法 (2)MGT、SUS、輔助酵素的大量表現與純化製程的最適化 (3)突變株篩選方法的建立與測試 (4)利用定點突變/隨機突變法對MGT 醣基鍵結區與受質鍵結區進行改造 第二年至第三年主要工作項目包括： (1)篩選具有高位向專一性與醣基多樣性的突變株，進行大量表現與純化 (2)突變株的活性與產物的分析鑑定 (3)統合MGT、SUS、輔助酵素，建立兼具高位向專一性及醣基多樣性的quercetin 醣基 衍生物的合成平台。
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    設計並建立以酵素催化合成醣基化黃酮素化合物之平台
    (2013)
    李耀坤
    ;
    Li Yaw-Kuen
    ;
    國立交通大學應用化學系（所）
    醣基化(glycosylation)為生物合成中常見的修飾反應，分子的親疏水性、溶解度、生物活 性及構形等會隨之改變。本計畫的主要目的是以枯草桿菌(Bacillus cereus)的大環內酯醣 基轉移酶(macrolide glycosyltransferases，MGT)為主，配合碗豆的蔗糖合成酶(sucrose synthase，SUS)與其它酵素，建立一個兼具高位向專一性及醣基多樣性的類黃酮醣基衍 生物生產平台。其中我們將以槲皮素為模型，針對MGT 的兩個鍵結區--醣基鍵結區與 受質鍵結區--進行突變改造，增加醣基的選擇性和槲皮素醣基化位向的專一性。除了 MGT 的突變與其表現和純化，我們也將建立一套篩檢不同位向專一醣基化突變株的方 法，期望此平台的建立，能對槲皮素及相關類黃酮類的醣基化有更進一步的了解。 第一年至第二年主要工作項目包括： (1)轉糖酵素的活性和產物分析方法 (2)MGT、SUS、輔助酵素的大量表現與純化製程的最適化 (3)突變株篩選方法的建立與測試 (4)利用定點突變/隨機突變法對MGT 醣基鍵結區與受質鍵結區進行改造 第二年至第三年主要工作項目包括： (1)篩選具有高位向專一性與醣基多樣性的突變株，進行大量表現與純化 (2)突變株的活性與產物的分析鑑定 (3)統合MGT、SUS、輔助酵素，建立兼具高位向專一性及醣基多樣性的quercetin 醣基 衍生物的合成平台。