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螢光蛋白雷射捕陷結晶化動力學：藉由非線性顯微成像研究光壓誘發相分離及晶核形成
(2012)
三浦篤志
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Miura Atsushi
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國立交通大學應用化學系（所）
螢光蛋白雷射捕陷結晶化動力學：藉由非線性顯微成像研究光壓誘發相分離及晶核形成
(2012)
三浦篤志
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Miura Atsushi
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國立交通大學應用化學系（所）
本計畫包含創新的光壓誘發蛋白質結晶生成法並且同時藉由多模態的影像/光譜顯微術來研宄晶體生成時動力學的方法。在第一年，我們會建構一個具有觀測多模態非線性影像能力的雷射捕陷(laser trapping)顯微系統:雙光子激發螢光影像(two-photon excitation fluorescence, TPEF)以及二階非線性影像Second-Order Nonlinear Imaging, SONI)。我們選擇綠色螢光蛋白（green fluorescent protein , GFP)以及GFP的突變體作為一個模型系統，並且藉由TPEF/SONI來觀察藉由光壓誘發結晶中液體-液體相分離（liquid-liquid phase separation, LLPS)的過程。同時利用時間解析三維 TPEF(Time-resolved three-dimensional TPEF imaging)影像可以觀測GFP在雷射捕陷光壓所造成的區域溶液濃度變化以及GFP分子在雷射捕陷焦點的移動分布。關於LLPS/droplet的形成，結合寬域影像(wide field imaging)及3D TPEF影像，我們可以得到在雷射捕陷結晶過程中所蘊含的動力學之重要資訊。第二年，首先我們會專注於經由SONI觀測GFP在雷射捕陷結晶過程中所形成的微小晶核。SONI提供了更高的靈敏度和更好的解析度以偵測大約100nm的晶核。同時，我們將會偵測GFP結晶所產生的二倍頻訊號(second harmonic generation)做為晶核初形成的指標。結合S0NI以及TPEF結果，我們可以深入的分析光壓誘發結晶過程：TPEF 偵測雷射捕陷誘發晶核的形成中濃度的變化；SONI則提供LLPS及近一步晶體成長之資訊。我們將會討論雷射捕陷結晶成長的速率，所形成的結晶也會經由晶體分析來研宄及比較相對於自然結晶相似與差異性。第三年，我們預計檢驗各種其餘的蛋白質如鐵蛋白，耐熱行直接溶血素，肌紅蛋白，細胞色素C、胰島素、清蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、病毒外套膜蛋白和膜蛋白等。對於蛋白質結晶研宄，蛋白質溶液中的液體-液體相分離是很重要的一項議題。而這項研宄結果將能對於化學領域，結晶化學領域，生化領域等等造成相當大的衝撃。因此，這些研宄結果對於雷射光鉗結晶中的雷射誘發結晶研宄是相當重要的。
螢光蛋白雷射捕陷結晶化動力學：藉由非線性顯微成像研究光壓誘發相分離及晶核形成
(2013)
三浦篤志
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Miura Atsushi
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國立交通大學應用化學系（所）
本計畫包含創新的光壓誘發蛋白質結晶生成法並且同時藉由多模態的影像/光譜顯微術來研宄晶體生成時動力學的方法。在第一年，我們會建構一個具有觀測多模態非線性影像能力的雷射捕陷(laser trapping)顯微系統:雙光子激發螢光影像(two-photon excitation fluorescence, TPEF)以及二階非線性影像Second-Order Nonlinear Imaging, SONI)。我們選擇綠色螢光蛋白（green fluorescent protein , GFP)以及GFP的突變體作為一個模型系統，並且藉由TPEF/SONI來觀察藉由光壓誘發結晶中液體-液體相分離（liquid-liquid phase separation, LLPS)的過程。同時利用時間解析三維 TPEF(Time-resolved three-dimensional TPEF imaging)影像可以觀測GFP在雷射捕陷光壓所造成的區域溶液濃度變化以及GFP分子在雷射捕陷焦點的移動分布。關於LLPS/droplet的形成，結合寬域影像(wide field imaging)及3D TPEF影像，我們可以得到在雷射捕陷結晶過程中所蘊含的動力學之重要資訊。第二年，首先我們會專注於經由SONI觀測GFP在雷射捕陷結晶過程中所形成的微小晶核。SONI提供了更高的靈敏度和更好的解析度以偵測大約100nm的晶核。同時，我們將會偵測GFP結晶所產生的二倍頻訊號(second harmonic generation)做為晶核初形成的指標。結合S0NI以及TPEF結果，我們可以深入的分析光壓誘發結晶過程：TPEF 偵測雷射捕陷誘發晶核的形成中濃度的變化；SONI則提供LLPS及近一步晶體成長之資訊。我們將會討論雷射捕陷結晶成長的速率，所形成的結晶也會經由晶體分析來研宄及比較相對於自然結晶相似與差異性。第三年，我們預計檢驗各種其餘的蛋白質如鐵蛋白，耐熱行直接溶血素，肌紅蛋白，細胞色素C、胰島素、清蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、病毒外套膜蛋白和膜蛋白等。對於蛋白質結晶研宄，蛋白質溶液中的液體-液體相分離是很重要的一項議題。而這項研宄結果將能對於化學領域，結晶化學領域，生化領域等等造成相當大的衝撃。因此，這些研宄結果對於雷射光鉗結晶中的雷射誘發結晶研宄是相當重要的。