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三帖皂?生合成酵素之蛋白質工程及其產生具生物活性化合物之研究
(2014)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系（所）
三萜皂苷生合成酵素之蛋白質工程及其產生具生物活性化合物之研究三萜皂苷化合物由一系列具親脂性的三萜類單元以及親水性的醣基單元所組成。三萜皂苷化合物普遍存在於植物、黴菌、與海洋生物。最近之研究顯示三萜皂苷化合物具有包括抗發炎、抗黴菌、抗細菌、抗寄生蟲、及抗腫瘤等多樣之生理活性。由三萜皂苷化合物之生合成研究，顯示其結構多樣性主要是由：（1)氧化鯊烯環化及重組成不同之多個立體中心之多環產物；（2)在環化產物之多個不同之碳原子之位置進行氫氧基化或氧化；（3)在氫氧基位置進行醣基轉移反應形成最終之皂苷產物。在本實驗室之前的研究中，我們利用基因工程結合產物分離與鑑定之技術，探討酵母菌之氧化鯊烯環化酵素所催化之環化重組反應之結構-功能-作用機制關係，並由其中分離出多個在環化或重組過程中被中斷之中間產物。這些結果支持酵素之結構-功能-作用機制關係以及提供作為未來藥物應用之基礎。另外，在所產生之中間產物，利用三萜類生合成之修飾酵素進行官能基或衍生物之修飾，將可增加其結構之多樣性以及幫助其生理活性。為了進一步探討氧化鯊烯環化酵素所催化之環化重組反應之結構-功能-作用機制關係，並獲得更多具結構多樣性之三萜類化合物，我們將繼續對酵母菌及其它物種之氧化鯊烯環化酵素進行蛋白質工程，以期能獲得更多具結構多樣性之中間或非天然產物。同時我們也將選殖及表現三萜類生合成途徑之修飾酵素如氫氧化酵素及醣基轉移酵素進行in vitro及 in vivo之蛋白質表現。經in vitro表現之蛋白質將先進行純化及原先受質之活性測試。同時，上述蛋白亦將進行in vivo之共表現以使其直接生成三萜皂苷化合物。接著，則將針對所生合成出之中間或非天然產物之三萜皂苷化合物進行溶血、抗菌及抗腫瘤藥物之活性測試。本計畫在未來三年之工作目標將進行以下數項之工作： (1)不同物種之氧化鯊烯環化酵素之基因合成及分子選殖和蛋白質表現。 (2)不同物種之氧化鯊烯環化酵素之蛋白質工程生合成裁製修飾截短或神奇之產物。 (3)不同物種之氧化鯊烯環化酵素之變種產生之修飾截短或神奇產物之分離與結構確認。 (4)三萜類生合成途徑之氫氧化修飾酵素之基因序列最適化、合成、分子選殖、功能性表現、及蛋白質純化。 (5)三萜類生合成途徑之醣基轉移酵素之基因序列最適化、合成、分子選殖、功能性表現、及蛋白質純化。 (6)三萜類生合成途徑之氫氧化修飾酵素及醣基轉移酵素對於其原生受質之活性分析。 (7)三萜類生合成途徑之修飾酵素之蛋白質工程及對於其原生受質之活性分析。 (8)三萜皂苷衍生化合物於溶血活性之活性分析。 (9)三萜皂苷衍生化合物於抗腫瘤活性之活性分析。 (10)三萜皂苷衍生化合物於抗菌活性之活性分析。
三帖皂?生合成酵素之蛋白質工程及其產生具生物活性化合物之研究
(2013)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系（所）
三帖皂?生合成酵素之蛋白質工程及其產生具生物活性化合物之研究
(2015)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系（所）
以臺灣鱟醣分子結合蛋白抑制病原性細菌---利用單株抗體結合質譜技術探討 HPL-多醣作用之醣蛋白體特徵(子計畫二)( II )
(2015)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系（所）
以臺灣鱟醣分子結合蛋白抑制病原性細菌-利用單株抗體結合質譜技術探討 HPL-多醣作用之醣蛋白體特徵(子計畫二)( I )
(2014)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系（所）
仿生太陽能電池元件及其光電能量轉換機制研究（創新啟動補助方案）
(2009)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系（所）
仿生太陽能電池元件及其光電能量轉換機制研究---子計畫一(I)
(2007)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系(所)
仿生太陽能電池元件及其光電能量轉換機制研究---子計畫一(III)
(2009)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系（所）
仿生太陽能電池元件及其光電能量轉換機制研究---子計畫一：(II)
(2008)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系(所)
仿生太陽能電池元件及其光電能量轉換機制研究---總計畫(I)
(2007)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系(所)
人類能源需求於 2050 年時將倍增、於2100 年時將成長3 倍、而現有能源將日趨短缺。未來新能源之獲得將以豐富且乾淨之太陽輻射為最終來源。但如何開發具有可微調其電子能帶之太陽能轉能材料為人類社會未來之重要挑戰之一。其中、解決之道之一為開發具高效率分子層級能階轉換之仿光合作用系統以作為太陽能轉能之應用。本計畫之最終目標為開發一熱穩定且可有效進行光電能量轉換之仿光合作用(光激發/電荷分離/電子轉移等反應)於一體之單一金屬蛋白質複合物或複合物陣列(仿生光催化系統)。另外、瞭解此仿生光催化系統之能量吸收及轉換過程中之能階分佈及電子轉移動力學為一重要之基礎課題。因此，我們提出三個相互關聯之子計畫，經由跨領域整合研究以開發此一仿生光催化系統，並研究其能階分佈與能量轉換機制。在子計畫一我們將設計及合成含各式金屬之不同紫質及其衍生物為基礎之供給-接受體系統，以提供作為子計畫二及三之人造蛋白質重組及其相關之太陽光電與基礎動力學研究。子計畫二則將以脫輔基肌紅蛋白為模板進行蛋白質工程之改造，以將其轉化成為具有各種不同能帶調控或氧化-還原態及電子轉移能力之金屬蛋白、並將其與子計畫一之不同紫質及其衍生物為基礎之供給-接受體系統進行重組，及應用於光電能量轉換與反應機制之研究。第三子計畫則將利用第一級第二子計畫所提供之分子材料製成仿生太陽能電池元件並量測其光電轉換效率，同時利用皮秒及飛秒之時間解析光譜技術以探索此一能量轉化過程之基礎動力學機制。
仿生太陽能電池元件及其光電能量轉換機制研究---總計畫(II)
(2008)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系(所)
仿生太陽能電池元件及其光電能量轉換機制研究---總計畫(III)
(2009)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系（所）
利用氧化鯊烯環化酵素作為篩選胜﹝月太﹞適合體及其擬胜﹝月太﹞之研究(I)
(2005)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系(所)
氧化鯊烯環化酵素為負責催化哺乳類中之膽固醇與黴菌中之麥角脂醇生合成途徑中共同中間產物，羊毛脂醇，之合成。另外、在植物中氧化鯊烯環化酵素利用相同之受質，(3S)-2,3-氧化鯊烯，以生合成環阿屯醇作為植物脂醇生合成之前驅物。這一酵素由於其可作為調控哺乳動物之膽固醇、黴菌之麥角脂醇及植物脂醇二級代謝物之生合成，進而影響血液中膽固醇濃度之高低、黴菌及病原性微生物如錐蟲之複製生長、及植物脂醇代謝物之生合成、因而廣泛被作為有效發展抗原蟲、抗黴菌、及降低膽固醇藥物之重要標的。而在化學及生化轉化酵素所催化的反應中，以氧化鯊烯環化酵素為代表的環化、重組及氧化反應以生成三.類化合物，可一步催化最少十個共價鍵之斷裂及十個共價鍵之形成，將非環狀反應物催化形成多環狀產物，並產生最少六個立體中心，因而成為自然界中最複雜與吸引人之生物轉化反應之一。另外，此類酵素所催化反應之產物具有結構之多樣性，目前已有超過90 種以上以C30H50O 為其分子式之三.類化合物是經由氧化鯊烯環化之途徑所獲得。近年來對於氧化鯊烯環化酵素之研究主要集中於對於氧化鯊烯環化酵素之結構-功能-作用機制關係之探討，及其作為開發抗黴菌或降低膽固醇藥物之基礎平台。本實驗室經由利用隨意突變與導向演化之篩選策略，成功的改變氧化鯊烯環化酵素之產物專一性與部份解構其負責之酵素活性胺基酸，確認出可能負責受質進入酵素活性區域之途徑及負責其A 環環化反應之穩定作用的環狀區域，此一區域可能對所有之環化酵素均扮演極重要之角色。另外亦經由定點突變之產物分析，成功分離出部份重組之中間產物，確認其反應中間物及其相對應負責之胺基酸序列。對於以氧化鯊烯環化酵素作為藥物開發之標的及增進對氧化鯊烯環化酵素之結構-功能-作用機制關係的瞭解，我們已突破以往不易獲得乾淨單一純化酵素的瓶頸，成功的由牛肝中純化出一在銀染之下為單一蛋白質之牛肝氧化鯊烯環化酵素，未來我們將以所純化之牛肝氧化鯊烯環化酵素，作為篩選抗黴菌或降低膽固醇藥物之基礎平台。我們將以勝.作為篩選材料，建構噬菌體表現勝.庫及奈米粒子共軛之隨意勝.庫，利用親和力遞增之交互作用篩選出可與氧化鯊烯環化酵素作用之勝.序列。所篩選出來之勝.將進一步合成確定序列之多勝.，確認其交互作用強度與專一性。將利用表面電漿共振之即時反應偵測以進行其鍵結動力學與專一性，另外亦將利用核磁共振與超快飛秒分子雷射等分析工具，以測定其鍵結能力、反應機制、及結構-抑製作用關係之探討。而所獲得具有親和能力之勝.序列將進一步以修飾勝.、非勝.類似物等擬勝.進行改良以提高其親和力及專一性，以在將來作為前導藥物之設計及合成。因此，本計畫在未來三年之研究工作目標將分為以下數項： 1．純化足量之氧化鯊烯環化酵素以作為蛋白質-勝.交互作用之研究。 2．免疫產生氧化鯊烯環化酵素之單株抗體以作為篩選勝.適合體之用。 3．建構噬菌體勝.庫及利用親和力篩選策略篩選與氧化鯊烯環化酵素有交互作用之勝.適合體。 4．合成七胺基酸之隨意組合式勝.庫並將其共軛鍵結於奈米金粒子以進行氧化鯊烯環化酵素之組合勝.適合體之篩選。 5．測定與氧化鯊烯環化酵素作用之勝.適合體之胺基酸序列。 6．利用表面電漿共振之即時反應偵測以測定勝.適合體之結合及解離常數與專一性。 7．利用核磁共振測定氧化鯊烯環化酵素-勝.適合體之結構-抑製作用關係。 8．利用超快飛秒分子雷射測定氧化鯊烯環化酵素-勝.適合體之結合對環化機制中碳陽離子之轉移機制。 9．設計及合成修飾勝.或非勝.類似物等擬勝.進行改良以提高其親和力、專一性或穩定度，以在將來作為前導藥物之設計及合成。本計畫之執行，對於氧化鯊烯環化酵素之結構-功能-作用機制之關係及可能之勝.作為降低膽固醇及抗黴菌藥物之研究，將可有進一步之瞭解，並可提供作為未來設計可與氧化鯊烯環化酵素有親和作用之適合體以作為藥物開發及生物科技應用之基礎。
利用氧化鯊烯環化酵素作為篩選胜太/核酸Aptamer之研究
(2004)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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交通大學生物科技研究所
病原性微生物如錐蟲和白色念珠菌對於人類，尤其是第三世界國家及愛滋病人，之健康已造成嚴重威脅。然而目前用於治療這些疾病之藥物常因其藥物毒性，有效性及抗藥性而降低其效果或限制其使用。另一方面，心臟血管疾病之發生與血液中膽固醇濃度之高低存在密切關係，因此發展降膽固醇藥物將對預防心臟血管疾病有極大助益。脂醇和三帖類化合物之生合成途徑廣泛存在於生物體內，為有效發展抗原蟲、抗黴菌、及降低膽固醇藥物之重要標的。氧化鯊烯環化酵素為脂醇和三帖類化合物之生合成途徑中之重要酵素，負責催化(3S)-2,3-氧化鯊烯之環化、重組及氧化反應，以在黴菌及哺乳類中生成羊毛脂醇，在植物中生成環阿屯醇。另外，目前已有超過90 種以上以C30H50O 為其分子式之三帖類化合物是經由氧化鯊烯環化之途徑所催化。過去對氧化鯊烯環化酵素所催化之反應途徑及機制由於不易純化其酵素而無法作進一步之研究。本實驗室先前對氧化鯊烯環化酵素利用隨意突變與導向演化之篩選策略，成功的改變酵素之產物專一性與解構其負責之酵素活性氨基酸，並利用此一成果進一步確認出可能負責其受質進入酵素活性區域之途徑及負責其 A 環環化反應之穩定作用的環狀區域，此一區域可能對所有之環化酵素均扮演極重要之角色。另外，本實驗室以牛肝為氧化鯊烯環化酵素純化之來源，成功突破過去不易獲得乾淨單一純化酵素的瓶頸，獲得一在銀染之下為單一蛋白質之牛肝氧化鯊烯環化酵素，這一結果將可進一步作為瞭解酵素之結構與功能關係或開發以氧化鯊烯環化酵素為標的之抗黴菌或降低膽固醇藥物之基礎平台。為了進一步延伸抗氧化鯊烯環化酵素之藥物開發及增進對氧化鯊烯環化酵素之結構-功能關係的瞭解，我們採用組合式之策略以篩選能和氧化鯊烯環化酵素有親和力及專一性之核酸及生太作為前導藥物之標的。我們將利用光誘發反應配位體指數遞增演化以篩選可與標的作用之核酸序列。我們也將建構二個隨意生太庫以篩選可和氧化鯊烯環化酵素作用之生太序列，並利用分子交互作用系統、超快飛秒分子雷射及核磁共振等方法進行鍵結能力、結構及分子動力模擬等動力學測試。最後所獲得之生太序列將進一步以修飾生太或非生太類似物進行改良以提高其親和力及專一性，以在將來作為前導藥物之設計及合成。因此，本計畫在未來三年之研究目標將分為以下數項： 1．純化足量之氧化鯊烯環化酵素以作為蛋白質-核酸及蛋白質-生太交互作用之研究。 2．設計及合成寡核酸探針並進行氧化鯊烯環化酵素之光誘發反應配位體指數遞增與聚合脢連鎖反應放大。 3．氧化鯊烯環化酵素之蛋白質-核酸膠體遲滯電泳分析，寡核酸序列之選殖、定序、及結構與鍵結常數測定。 4．建構噬菌體生太庫及利用演化策略篩選氧化鯊烯環化酵素-生太aptamers 5．合成七氨基酸之組合式生太庫及利用半合理策略篩選氧化鯊烯環化酵素-生太aptamers 6．測定與氧化鯊烯環化酵素作用之生太aptamers 之氨基酸序列。 7．利用不同生物物理方法進行氧化鯊烯環化酵素-生太aptamers 之鍵結能力、結構及分子動力模擬等動力學測定。 8．設計及合成第二個含修飾或非生太類似物之生太庫以提高其親和力及專一性，作為將來前導藥物之模板。本計畫之執行，對開發以氧化鯊烯環化酵素為標的之降低膽固醇及抗黴菌藥物之研究將提供一核酸及生太藥物之新選擇，並對酵素之結構-功能關係的探討有進一步之瞭解，並可提供作為未來設計可與氧化鯊烯環化酵素有親和作用之 aptamers 以作為製藥及生物科技應用之基礎。
利用氧化鯊烯環化酵素作為篩選胜月太適合體及其擬胜月太之研究(II)
(2006)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系(所)
弧菌屬微生物代謝產物之分析、活性測試及其固定化方法之研發與改進 (I)
(2001)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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交通大學生物科技學系
計畫目標: 本計畫之總目標為擬利用微生物對溫度及酸鹼值之適應範圍較廣, 生命週期較長, 與成本較低之特性, 以發展具特定專一性之感測器, 偵測水產品中特定致病微生物在代謝過程之中間代謝產物, 以作為檢測其衛生品質之標準.分年度工作目標: 在第一年將以弧菌屬微生物之成份中可能之致病因子成份背景進行探討, 致病因子之收集與分析, 並將對受質進行活性測試以確認其代謝產物.在第二年將繼續對所確認之致病因子成份進行活性之測試, 以確定其功能或可能之作用機制.在第三年將針對微生物之固定化方法進行研發.研究重點將探討包括吸附法、共價鍵、膠囊化、陷入法、與交叉結合法等固定化方法對微生物之穩定性、生命週期, 及活性的影響.第四年則將著重於將微生物固定與檢測之相互結合, 以試圖發展具專一性之快速、簡易微生物感測器、以達到對衛生品質的線上監測, 並有效降低檢測成本, 增進飲食衛生與安全.架構( 重要工作項目 ): 本年度之重要工作項目將包括: 1.可能致病因子之成份探討: 將針對弧菌屬細菌之胞表面相關物質及細胞外產物成分, 如蛋白質分解酵素( protease ), 溶血素( hemolysin ), 血凝集素( hemagglutinin ), 細胞毒素( cytotoxin ), 殺白血球毒素( leukocidin ), 和脂多糖( lipopolysaccharide )等成分進行探討, 尋找具特異性之可能致病因子.2.致病因子之收集: 將利用生物化學之方法, 以弧菌屬細菌外膜蛋白質( outer membrane protein )為目標, 收集與溶血素相關之致病因子.3.致病因子之分析: 將利用SDS-PAGE電泳, 對所收集得到之致病因子進行分析, 並估算其可能之分子量.4.致病因子之活性測試: 將利用所純化之外膜蛋白質進行對受質活性之測試, 以確定其功能或可能之作用機制.預期效益: 本計畫預期將發展出一有效檢測水產品中致病弧菌屬之檢測技術以取代傳統費時且緩不濟急之方法.本計畫可預見將產生以下數項預期效益: 1.可實際應用於現有國內生產與國外進口之水產品品質衛生管制制度.2.將可建立一制度化之衛生品質認證制度, 以提高國人消費水產品之衛生安全保障, 確保國人健康, 再配合適當之消費者教育, 必能提高水產食品之消費量; 並可鞏固外銷市場.3.將可加強業者自主品管之能力, 加速產業升級, 提升水產產業之國際競爭力.
氧化鯊烯環化酵素之作用機制探討與酵素結構鑑定(I)
(2000)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技研究所
氧化鯊烯環化酵素之作用機制探討與酵素結構鑑定(II)
(2001)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
;
交通大學生物科技研究所
氧化鯊烯環化酵素之導向演化的研究及其光親和標記的設計與合成
(2000)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
;
交通大學生物科技研究所
氧化鯊烯環化酵素之易曲性及其於形成具生物活性產物之研究
(2011)
吳東昆
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WU TUNG-KUNG
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國立交通大學生物科技學系（所）
氧化鯊烯環化酵素之易曲性及其於形成具生物活性產物之研究氧化鯊烯為黴菌中麥角脂醇、哺乳動物之膽固醇、及植物中之植物脂醇等生合成途徑中最後一個共同之中間產物。氧化鯊烯環化酵素催化直鏈之氧化鯊烯之環化及重組反應形成具多個立體中心之多環產物如四環之羊毛脂醇和環阿屯醇、五環之-香桂素和羽扇醇，以及植物之二級代謝產物。針對氧化鯊烯環化酵素所催化反應之產物多樣性及反應機制之複雜性，以及其可能作為發展降膽固醇、抗細菌、抗黴菌、及抗癌藥物標的之潛力，已吸引科學家對其投入超過半個世紀以上時間之研究。本實驗室利用基因遺傳工程技術以及產物分離和鑑定等策略對酵母菌之氧化鯊烯環化酵素所催化之環化重組反應之結構-功能-作用機制關係有初步之了解。我們在過去以來，已確認數個對環化或重組過程中扮演重要角色之胺基酸，並由氧化鯊烯環化酵素之變種中分離數個在環化或重組過程中被中斷之中間產物。這些結果支持酵素之結構-功能-作用機制關係以及提供作為未來藥物應用之基礎。雖然截至目前所獲得之結果甚為樂觀，但若能對蛋白質之可塑性及所產生產物專一性或多樣性之過程有進一步之了解，將可對將來將此類在氧化鯊烯環化過程之中間產物應用於降膽固醇或抗黴菌藥物之開發有所幫助。另外若在所產生之中間產物，利用三萜類生合成之修飾酵素進行官能基或衍生物之修飾，將可增加其結構之多樣性以及幫助其生理活性。為了達到上述之目標，我們將繼續探討酵母菌之氧化鯊烯環化酵素之結構-功能-作用機制關係，研究蛋白質之混雜性，及設計具新功能之酵素。同時我們也將選殖及表現三萜類生合成途徑之修飾酵素如氫氧化酵素、醣基轉移酵素、及醯基轉移酵素。經由酵素修飾作用將可增加所獲得三萜類中間產物之結構多樣性。所修飾之三萜類中間產物將用於抗菌及抗癌藥物之活性測試。因此，本計畫在未來三年之工作目標將進行以下數項之工作: (1) 針對氧化鯊烯環化酵素之可能進行分歧演化之區域進行蛋白質工程研究。 A. 氧化鯊烯環化酵素之分歧演化之區域之生物資訊分析。 B. 氧化鯊烯環化酵素之分歧演化之區域之蛋白質工程。 C. 利用2,3:22,23-雙氧化鯊烯做為可能之受質以增加其官能基之可行性。 D. 利用GC-MS 及LC-MS 分析所產生之截短或神奇之產物。 (2) 分子選殖及蛋白質表現三萜類生合成途徑之修飾酵素及裁製修飾截短或神奇之產物。 A. 分子選殖及蛋白質表現三萜類氫氧化酵素及裁製修飾截短或神奇之產物。 B. 分子選殖及蛋白質表現三萜類醣基轉移酵素及裁製修飾截短或神奇之產物。 C. 分子選殖及蛋白質表現三萜類醯基轉移酵素及裁製修飾截短或神奇之產物。 (3) 三萜類新產物之抗腫瘤及抗細菌和抗黴菌生理活性分析。 A. 細胞培養準備以進行藥物效應分析。 B. 評估所產生之截短或神奇之產物或其裁製修飾物之細胞毒性。 C. 評估所產生之截短或神奇之產物或其裁製修飾物對細胞增生及程式性凋亡之影響。 D. 評估所產生之截短或神奇之產物或其裁製修飾物於程式性凋亡過程之形態變化。 E. 評估所產生之截短或神奇之產物或其裁製修飾物於DNA 斷裂之分析。 F. 評估所產生之截短或神奇之產物或其裁製修飾物於抗菌活性之分析。 G. 評估所產生之截短或神奇之產物或其裁製修飾物於抗黴菌活性之分析。本計畫之執行，對於氧化鯊烯環化酵素之結構-功能-作用機制之關係將可有進一步之了解，並可能產生具新功能或能產生新產物之新酵素，增加所產生截短或神奇之產物或其裁製修飾物之結構多樣性，以及提供作為未來獲得具氧化鯊烯環化酵素抑制活性之抑制劑及其作為抗細菌、抗黴菌、及抗癌藥物之應用。