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利用基因體方法研究人類病原白色念珠菌致病化因素之功能( III )
(2009)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系(所)
利用基因體方法研究人類病原白色念珠菌致病化因素之功能(I)
(2007)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系(所)
近年來，人類真菌感染(fungal infections) 的情形有日益增加的趨勢。這其中以白色念珠菌(Candida albicans) 為最大宗，居美國各式院內感染的第四位；相關的醫療費用估計為每年10 億美金。雖然臨床上有抗真菌藥物，然而這些藥物普遍有副作用、對新出現及一些特定的菌株無效、及造成抗藥性流行等問題。因此，發展及引進新的觀念及策略，由不同的角度及方法來瞭解真菌感染的問題是有必要的。到目前為止，已有幾個與調控白色念珠菌致病機制有關的因素，例如環境刺激、營養之取得、抗藥性、及毒性因子(virulence factors)(如形態變化、分泌性水解酵素、性狀轉換)等。但是對整個致病機制的調控迴路(regulatory network) 及各別因素間彼此的關連及其協同作用仍有很多不清楚。因此，這個研究的長程目標就是要針對白色念珠菌致病機制的調控因子的作用及其彼此間的關連與協同作用進行瞭解。在此研究計劃中，我們所要提出的策略是以分子遺傳及功能性基因組為工具-特別著重在同源置換(homologous replacement) 及去氧核糖核酸微陣列(DNAmicroarray) 來分析及探索對環境刺激之感應與反應(如特定元素之取得、寄主抗菌反應)及毒性因子(如形態變化、分泌性水解酵素等)所誘發的致病化(pathogenesis) 過程中，這些因素的訊號傳遞途徑及其與致病化整體調控迴路的關係。此子計劃有三個目標：第一個是由CaEno1 切入，對Efg1 途徑展開功能性研究。Efg1 在白色念珠菌中同時調控幾個致病化因素，是一個主要的致病化調控樞紐。CaEno1 則受其調節。CaEno1 本身是具有多功能的蛋白，最早是以醣解酵素的功能被發現；它不但是白色念珠菌細胞壁的主要成分，也是白色念珠菌感染寄主時的主要抗原，同時也影響白色念珠菌的致病化過程，因此它在Efg1 途徑中所扮演的角色就很耐人尋味了。由於目前白色念珠菌有性世代(sexual cycle)尚未被發現，也缺乏適當的質體(plasmid)，因此基因突變的方法將以同源置換的方式直接對白色念珠菌基因體進行gene targeting 而達成。第二個目標是以去氧核糖核酸微陣列為工具，刻劃由前述之特定致病機制因素對白色念珠菌造成的整體基因組的表現。主要是要瞭解各別因素的訊號傳遞途徑及在致病化過程中對菌體的影響。第三個目標則是要揭開這些訊號傳遞途徑彼此間協同調控的關連，尤其是與主要致病化過程中的樞紐Efg1 途徑的關聯。此研究之成果，除了可以對真菌致病機制的調控有基礎性的瞭解外，更可在過程中揭露有潛力作為活性阻斷目標的基因產物或訊息傳遞步驟。若將來能有效的阻斷這些目標，就有可能利用它們及相關知識去發展新一代的抗真菌方法或藥物。因此，此研究計劃與「基因體醫學國家型科技計畫」的發展目標一致。
利用基因體方法研究人類病原白色念珠菌致病化因素之功能(II)
(2008)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系(所)
探討一個新型態的抗真菌蛋白的活性及調控機制
(2016)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系（所）
探討一個新型態的抗真菌蛋白的活性及調控機制
(2015)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系（所）
探討真菌相互拮抗作用以開發抗真菌藥物
(2013)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系（所）
研究受毒性因子EFG1調控之糖解蛋白及分子幫浦在白色念珠菌致病機制中的功能
(2012)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系（所）
研究受毒性因子EFG1調控之糖解蛋白及分子幫浦在白色念珠菌致病機制中的功能近年來伺機型真菌造成的感染病症大量地增加。其中，念珠菌(Candida)是最常見的真菌病原。在美國，念珠菌已升為院內感染的第四常見致病菌。在台灣某教學醫院的念珠菌感染案例更是從1981到2000間增加了16倍。我們的長程目標，就是要瞭解白色念珠菌的致病機制及其調控迴路，尤其是形態變化/毒性因子及抗藥性調控，以尋找合適的抗真菌標的及方法。EFG1是白色念珠菌致病機制的主要轉錄因子，影響許多致病途徑的運作，如形態變化、抗藥性、及環境壓力。我們先前DNA 微陣列結果顯示有7個糖解酵素蛋白及8個分子幫浦在4-Nitroquinoline 1-oxide或miconazole藥物影響下受EFG1所調控。由於糖解蛋白涉及能量轉換及/或作為細胞表面成分，而分子幫浦即為細胞表面蛋白，且其運作涉及能量轉換。而且糖解蛋白enolase也被證實除了是念珠菌細胞表面蛋白外，也涉及抗藥性。因此本計畫的目標即是針對這些受EFG1調控的糖解酵素蛋白及分子幫浦來進行功能研究，以瞭解它們及所屬途徑在整個致病機制調控迴路中的角色，特別是在形態變化/毒性因子與抗藥性調控中的作用、彼此的關係、及與EFG1的交互作用。我們除了以knock-out cassette進行同源置換來建構單基因突變株外，也將建構雙基因或多基因突變株，瞭解這些基因在調控迴路中相對的位置以找到特定基因或調控迴路上的位點。此研究所得資訊能幫助我們鑑定可以成為抗真菌藥物的標的與研發新的抗菌策略。
研究受毒性因子EFG1調控之糖解蛋白及分子幫浦在白色念珠菌致病機制中的功能
(2010)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系（所）
研究受毒性因子EFG1調控之糖解蛋白及分子幫浦在白色念珠菌致病機制中的功能近年來伺機型真菌造成的感染病症大量地增加。其中，念珠菌(Candida)是最常見的真菌病原。在美國，念珠菌已升為院內感染的第四常見致病菌。在台灣某教學醫院的念珠菌感染案例更是從1981到2000間增加了16倍。我們的長程目標，就是要瞭解白色念珠菌的致病機制及其調控迴路，尤其是形態變化/毒性因子及抗藥性調控，以尋找合適的抗真菌標的及方法。EFG1是白色念珠菌致病機制的主要轉錄因子，影響許多致病途徑的運作，如形態變化、抗藥性、及環境壓力。我們先前DNA 微陣列結果顯示有7個糖解酵素蛋白及8個分子幫浦在4-Nitroquinoline 1-oxide或miconazole藥物影響下受EFG1所調控。由於糖解蛋白涉及能量轉換及/或作為細胞表面成分，而分子幫浦即為細胞表面蛋白，且其運作涉及能量轉換。而且糖解蛋白enolase也被證實除了是念珠菌細胞表面蛋白外，也涉及抗藥性。因此本計畫的目標即是針對這些受EFG1調控的糖解酵素蛋白及分子幫浦來進行功能研究，以瞭解它們及所屬途徑在整個致病機制調控迴路中的角色，特別是在形態變化/毒性因子與抗藥性調控中的作用、彼此的關係、及與EFG1的交互作用。我們除了以knock-out cassette進行同源置換來建構單基因突變株外，也將建構雙基因或多基因突變株，瞭解這些基因在調控迴路中相對的位置以找到特定基因或調控迴路上的位點。此研究所得資訊能幫助我們鑑定可以成為抗真菌藥物的標的與研發新的抗菌策略。
研究受毒性因子EFG1調控之糖解蛋白及分子幫浦在白色念珠菌致病機制中的功能
(2011)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系（所）
研究受毒性因子EFG1調控之糖解蛋白及分子幫浦在白色念珠菌致病機制中的功能近年來伺機型真菌造成的感染病症大量地增加。其中，念珠菌(Candida)是最常見的真菌病原。在美國，念珠菌已升為院內感染的第四常見致病菌。在台灣某教學醫院的念珠菌感染案例更是從1981到2000間增加了16倍。我們的長程目標，就是要瞭解白色念珠菌的致病機制及其調控迴路，尤其是形態變化/毒性因子及抗藥性調控，以尋找合適的抗真菌標的及方法。EFG1是白色念珠菌致病機制的主要轉錄因子，影響許多致病途徑的運作，如形態變化、抗藥性、及環境壓力。我們先前DNA 微陣列結果顯示有7個糖解酵素蛋白及8個分子幫浦在4-Nitroquinoline 1-oxide或miconazole藥物影響下受EFG1所調控。由於糖解蛋白涉及能量轉換及/或作為細胞表面成分，而分子幫浦即為細胞表面蛋白，且其運作涉及能量轉換。而且糖解蛋白enolase也被證實除了是念珠菌細胞表面蛋白外，也涉及抗藥性。因此本計畫的目標即是針對這些受EFG1調控的糖解酵素蛋白及分子幫浦來進行功能研究，以瞭解它們及所屬途徑在整個致病機制調控迴路中的角色，特別是在形態變化/毒性因子與抗藥性調控中的作用、彼此的關係、及與EFG1的交互作用。我們除了以knock-out cassette進行同源置換來建構單基因突變株外，也將建構雙基因或多基因突變株，瞭解這些基因在調控迴路中相對的位置以找到特定基因或調控迴路上的位點。此研究所得資訊能幫助我們鑑定可以成為抗真菌藥物的標的與研發新的抗菌策略。
研究調控子REP1在白色念珠菌中調節真菌抗藥性的功能(II)
(2007)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系(所)
研究調控子REP1 在白色念珠菌中調節真菌抗藥性的功能(二) 由於醫學的發展產生了各式各樣的醫療器材和藥物。這些新發展的普遍應用，使免疫系統功能不健全的病患壽命延長，再加上抗生素的不適當使用，使伺機型病原菌造成的感染病症大量地增加。其中尤以真菌感染的增加最為顯著，在近年來已成為院內感染的主要病因之一。以美國為例，念珠菌(Candida)已升為院內感染的第四常見致病菌。在台灣也不例外，念珠菌自1981 至2000 年間在北部某大醫院中造成院內感染的例子就增加了16 倍,成為最常見的院內感染的真菌致病原。因此，如何防治真菌感染已是一個刻不容緩的課題。惟目前抗真菌藥物種類並不多，而且多半伴隨著危險的副作用;尤有甚者，隨著大量使用抗真菌藥物，抗藥性菌株的出現也隨著增加。產生真菌抗藥的主要機制之一是過度表現藥物幫浦CDR1，使真菌細胞可將體內的藥物排出體外，減少藥物在體內的累積而產生抗藥性。為了瞭解CDRI 表現的調控機制，我們建構了一個lacZ 報告子(lacZ reporter)系統，用來篩選白色念珠菌(Candida albicans)的CDRI 的反式調控子(trans-acting regulatory factors) 。我們將CDR1 的起動子(promoter)和lacZ 基因結合，使得lacZ 的表現受控於CDR1 的起動子（CDR1p-lacZ）。將此系統轉形至啤酒酵母菌後，再以重組基因表現之方法篩選白色念珠菌的gene library，進而找出library 中能調控CDRI 表現的反式因子。在篩選所得之基因中，被我們命名為REP1 的基因在過度表現(over expression)時會提升 CDR1p-lacZ 在啤酒酵母菌中的表現。進一步實驗結果顯示，過度表現REP1 可改變啤酒酵母菌對抗真菌藥物的抗藥性。本研究乃是接續本實驗室上述成果，作進一步研究。目的是瞭解REP1 在白色念珠菌中所扮演的角色。REP1 和CaNTD80 有相似的DNA binding domain。而CaNTD80 已知與白色念珠菌產生抗藥性有關。為了偵測REP1 是否與白色念珠菌抗藥性的產生及表現有關，我們將會建構rep1/rep1 的突變株，以探討REP1 在白色念珠菌抗藥性所扮演的角色。因白色念珠菌是雙倍體，有兩套基因需要被突變。目前，一套的REP1 已順利被 ARG4 所取代而構建了REP1/rep1 的菌株，目前正在進行第二套的突變。此外，為進一步瞭解REP1 與CaNDT80 的關係，我們亦將建構rep1/rep1 Candt80/Candt80 的雙突變株。此外，除DNA binding domain 以序列相似性被預測出來外，目前對REP1 功能並無其它瞭解，因此將以區域交換(domain swapping)之方式來重組REP1 及CaNDT80 以瞭解其各區域的功能。
研究調控子REP1在白色念珠菌中調節真菌抗藥性的功能(II)
(2006)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系(所)
研究調控子REP1 在白色念珠菌中調節真菌抗藥性的功能(二) 由於醫學的發展產生了各式各樣的醫療器材和藥物。這些新發展的普遍應用，使免疫系統功能不健全的病患壽命延長，再加上抗生素的不適當使用，使伺機型病原菌造成的感染病症大量地增加。其中尤以真菌感染的增加最為顯著，在近年來已成為院內感染的主要病因之一。以美國為例，念珠菌(Candida)已升為院內感染的第四常見致病菌。在台灣也不例外，念珠菌自1981 至2000 年間在北部某大醫院中造成院內感染的例子就增加了16 倍,成為最常見的院內感染的真菌致病原。因此，如何防治真菌感染已是一個刻不容緩的課題。惟目前抗真菌藥物種類並不多，而且多半伴隨著危險的副作用;尤有甚者，隨著大量使用抗真菌藥物，抗藥性菌株的出現也隨著增加。產生真菌抗藥的主要機制之一是過度表現藥物幫浦CDR1，使真菌細胞可將體內的藥物排出體外，減少藥物在體內的累積而產生抗藥性。為了瞭解CDRI 表現的調控機制，我們建構了一個lacZ 報告子(lacZ reporter)系統，用來篩選白色念珠菌(Candida albicans)的CDRI 的反式調控子(trans-acting regulatory factors) 。我們將CDR1 的起動子(promoter)和lacZ 基因結合，使得lacZ 的表現受控於CDR1 的起動子（CDR1p-lacZ）。將此系統轉形至啤酒酵母菌後，再以重組基因表現之方法篩選白色念珠菌的gene library，進而找出library 中能調控CDRI 表現的反式因子。在篩選所得之基因中，被我們命名為REP1 的基因在過度表現(over expression)時會提升 CDR1p-lacZ 在啤酒酵母菌中的表現。進一步實驗結果顯示，過度表現REP1 可改變啤酒酵母菌對抗真菌藥物的抗藥性。本研究乃是接續本實驗室上述成果，作進一步研究。目的是瞭解REP1 在白色念珠菌中所扮演的角色。REP1 和CaNTD80 有相似的DNA binding domain。而CaNTD80 已知與白色念珠菌產生抗藥性有關。為了偵測REP1 是否與白色念珠菌抗藥性的產生及表現有關，我們將會建構rep1/rep1 的突變株，以探討REP1 在白色念珠菌抗藥性所扮演的角色。因白色念珠菌是雙倍體，有兩套基因需要被突變。目前，一套的REP1 已順利被 ARG4 所取代而構建了REP1/rep1 的菌株，目前正在進行第二套的突變。此外，為進一步瞭解REP1 與CaNDT80 的關係，我們亦將建構rep1/rep1 Candt80/Candt80 的雙突變株。此外，除DNA binding domain 以序列相似性被預測出來外，目前對REP1 功能並無其它瞭解，因此將以區域交換(domain swapping)之方式來重組REP1 及CaNDT80 以瞭解其各區域的功能。
選殖表現特定真菌分泌之抗真菌活性及其機制探討
(2014)
楊昀良
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YANG YUN-LIANG
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國立交通大學生物科技學系（所）