人類透明質酸水解脢和其抑制劑之研究開發

Abstract

Hyaluronidase(Hyal)已被廣泛地應用在醫療上，但醫藥級Hyal 的供應卻時常短缺。 因此，如何獲得人類重組Hyal (recombinant human Hyal)已然成為一個重要且具價值的課 題。已有證據顯示Hyal 可能有抗癌的效應並且能抑制腫瘤轉移，不過，目前的結論卻 相當不一致。例如Hyal-1 和Hyal-2 在不同的腫瘤裡的具體功能似乎互相矛盾，且尚無 法解釋其究理。所以，更進一步研究hyaluronidase 酵素活性與其對生理的影響，甚或是 開發具選擇專一性和較強抑制能力的抑制劑，都是目前急迫的議題。此外，Hyal 抑制劑 除了可當作治療arthroses 的醫藥物使用外，亦可結合抗生素，用在抗細菌治療上，特別 是對可生產hyaluronate lyase 的細菌。雖然肝素 (heparin)、黃酮類化合物 (flavonoids) 和 全磺化(fully O-sulfonated)之glycosaminoglycans 已被發現在試管試驗中(in vitro) 可抑制 牛睪丸之hyaluronidase (BTH) 活性。但是這些化合物僅具有微弱的抑製作用，所以到目 前為止，並沒有較具潛力或選擇性較高的抑制劑被發現。L-ascorbic acid 6-hexadecanoate (Vcpal)是近年來被發現對BTH 具有有較佳的抑制效果的化合物，其IC50 為56 μM。我 們因此計畫使用Vcpal 作為本研究之內標的物(「threshold」 compound)，透過competitive binding technique 篩選出對哺乳動物Hyals 作用較強的抑制劑。這種competitive binding technique 技術的發展將結合螢光共振能轉移技術(FRET)。本研究亦將開發以FRET 技術 進行準確的酵素動力分析。此外，依據蜜蜂毒液中hyaluronidase 與HA 的四單元醣 (tetrasaccharide)碎片的蛋白質晶體結構，人類Hyal 的相似模組(homology models)可以利 用電腦模擬技術預測出來。這些蛋白模組將被實際應用於Hyal 抑制劑的篩選上。 計畫案將於三年內執行，具體的主題包括︰ 第1-第2 年 (1) 人類Hyal-1 和Hyal-2 的基因重組和蛋白質表達 (2) 發展一種有效的方法分析Hyal 的酵素活性 (3) 發展一以 FRET 為基礎、篩選Hyal 抑制劑的平台 (4) 電腦模擬(structure simulation)人類Hyal-1 和Hyal-2 的蛋白質結構 (5) 合成玻尿酸衍生物作為FRET 酵素分析的基質(substrate) (6) 合成Vcpal 的衍生物作為抑制劑的標的 第2-第3 年 (1) 篩選Hyal 抑制劑 (2) 對篩選出的藥物做抑制效應的定量評估 (3) 用化學修飾法增進抑制劑的抑制效果 (4) Hyals 的酵素特性分析和基因突變的研究 (5) 哺乳動物Hyals 的酵素動力與催化機制的探討。