標題: Spinosyn生合成之三個氧-甲基轉移酵素對其鼠李醣基配醣體的功能性鑑定與受質專一性研究
Functional Characterization and Substrate Specificity of Three Spinosyn O-methyltransferases Towards Spinosyn Rhamnosyl Pseudoaglycone and Its Methylated Derivatives
作者: 龔若瑩
Kung, Juo-Ying
邱顯泰
Chiu, Hsien-Tai
生物科技學系
關鍵字: 氧-甲基轉移酵素;次級代謝物;天然物;聚酮類;生物合成;O-Methyltransferase;Secondary metabolites;Spinosyn;Polyketides;Biosynthesis
公開日期: 2008
摘要: 許多含醣次級代謝物可由放線菌所生成,其生物活性通常與其醣基有關,在次級代謝物醣基上進行甲基化修飾,可造成這些化合物在構型與疏水性等特性的改變,進而影響其生物活性。史拜諾辛(Spinosyn)是由放線菌刺醣多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)所生成之含醣次級代謝物,其結構含有一個胺基醣(forosamine)與一個三甲基化的鼠李醣(Rhamnose)。史拜諾辛在農業上已被廣為使用作為有害節肢動物的抑制劑。在史拜諾辛的生合成途徑中,spnI、spnK與spnH基因被推測為甲基化鼠李醣基的功能,藉由多重序列比對分析結果,推測其甲基的提供者為硫-腺苷甲硫胺酸(S-Adenosyl Methionine)。本研究成功的將SpnI、SpnK與SpnH於大腸桿菌中異體表達並大量純化而取得其可溶性蛋白質,且進行酵素學的研究。本研究結果顯示,SpnI、SpnK與SpnH皆可甲基化史拜諾辛之鼠李醣基配醣體 (Rhamnosyl Pseudoaglycone),且經由此三個酵素對鼠李醣基配醣體之催化活性速率與專一性,可推測SpnI為史拜諾辛氧-甲基化生合成途徑中第一個在鼠李醣基上進行甲基化的酵素(初始速率為112.8 μMmin-1),其次依序為SpnK與SpnH。另外,亦對此三個甲基轉移酵素進行反應pH值對酵素活性影響的研究,發現它們皆在鹼性環境下有最佳的催化活性:SpnI為pH 8.5~10.5;SpnK為9.0;SpnH則為8.0。此外亦發現SpnK與SpnH可藉由外加金屬離子來促進催化活性:SpnK在外加5 mM Mg2+時的活性最好;SpnH則在外加10 mM Mg2+時達到最佳活性。
更有趣的是,我們發現此三個史拜諾辛氧-甲基轉移酵素可不依次序對鼠李醣基表現出不同專一程度的催化活性。我們也因此在試管中合成出各種不同甲基化位置及多重甲基化的氧-甲基鼠李醣基配醣體,也進一步證明了SpnI、SpnK與SpnH的受質寬廣性。值得一提的是,本研究亦成功的在試管內以連續的酵素反應(In Vitro Tandem Enzyme Reactions)來生合成上述史拜諾辛的各種甲基化鼠李醣基配醣體,相信此等結果對應用對此三個或相關的酵素來試管中生合成各種天然藥物的甲基化衍生物的研發與應用,具有重大里程碑的意義。
URI: http://140.113.39.130/cdrfb3/record/nctu/#GT009528521
http://hdl.handle.net/11536/39040
顯示於類別:畢業論文