史拜諾辛生合成酵素與艾黴素還原酵素的分子機制與受質專一性研究

Abstract

二磷酸核苷醣(NDP-sugar)是核苷活化型式的醣類，在很多生物分子的生物合成為重要的前驅物(如含醣天然物)。本論文第一部分為利用二磷酸核苷醣生物合成酵素在試管內重組生物合成路徑的相關研究。二磷酸核苷葡萄醣-4,6-脫水酵素(Gdh)、二磷酸核苷醣-3,5-異構酵素(Epi)與二磷酸核苷-4-酮基醣還原酵素(Kre)為負責二磷酸胸苷鼠李醣的生物合成酵素，利用酵素於大腸桿菌(E. coli)異體中的表達與純化，進而鑑定酵素的功能與特性。其中，應用動力學研究二磷酸核苷葡萄醣-4,6-脫水酵素及其突變酵素，得以推論重要胺基酸在酵素催化反應之功能。此外，二磷酸核苷醣酮基還原酵素(DnmV)為參與TDP-L-daunosamine生合成途徑的關鍵酵素，本研究亦從E. coli中純化並鑑定其酵素功能。二磷酸核苷醣酮基還原酵素(DnmV)及其突變酵素的動力學研究結果顯示其催化機制應為順序式催化機制。本論文並利用二磷酸核苷醣組合式生物合成的策略，成功在試管內重組生合成數個非天然二磷酸核苷醣。 本論文第二部分，成功的在試管內重組史拜諾辛醣苷生物合成路徑，並利用多樣的二磷酸核苷醣為分子探針來研究鼠李醣轉移酵素(SpnG)之受質寬鬆性，研究結果顯示SpnG具有特殊的受質寬鬆性，並得利用其寬鬆性創造得新型的醣化產物。成功展現SpnG可為組合式生物合成的有效工具，以創造出史拜諾辛(Spinosyn)衍生物，而改造其生物活性。 總之，本研究利用二磷酸核苷醣生物合成酵素及醣基轉移酵素實現試管內重組天然物生物合成路徑，此策略提供以組合式生物合成創造新穎含醣天然物的契機，對天然物在藥物研發的應用上應有重要的價值與意義。