利用「自體螢光成像」及「拉曼光譜」技術探討白血球噬菌動態過程

Abstract

白血球細胞如巨噬細胞 (macrophage) 受外來入侵物例如細菌刺激後，能藉由變形運動向入侵物靠近，接著靠其偽足將入侵物噬入細胞內，此過程稱為吞噬作用 (phagocytosis)。在吞噬作用之後，白血球細胞可利用具有高細胞毒性之活性氧化物 (reactive oxygen species, ROS) 或酵素將外來異物分解。過去觀察此過程主要仰賴電子顯微鏡或光學螢光成像技術。前者僅能提供高解析度之形貌 (morphology) 上的訊息，也無法觀測活細胞。光學螢光成像雖可提供專一性影像，但細胞染色過程不但繁瑣，染劑對免疫細胞本身也屬於一種異物刺激。在此，我們利用共焦自體螢光成像 (confocal autofluorescence imaging) 及共焦拉曼顯微光譜 (confocal Raman micro-spectroscopy) 系統研究巨噬細胞吞噬酵母菌 (yeast) 之動態過程。發現在受刺激後，巨噬細胞內之自體螢光顯著增強。我們更進一步發現當酵母菌被吞噬入細胞內之後，相同的自體螢光集中在酵母菌周圍。此自體螢光之光譜特徵與 NADPH 氧化酶中之黃素蛋白 (flavoprotein) 吻合。以上觀察可解釋為含黃素蛋白之 NADPH 氧化酶在巨噬細胞受刺激後表現量增加，而巨噬細胞將酵母菌吞噬後，含 NADPH 氧化酶之囊泡會向內含酵母菌之吞噬體靠近並啟動活性氧化物的製造。為了支持以上解釋，並驗證 NADPH 氧化酶產生的活性氧化物的確作用於入侵之酵母菌，我們利用拉曼顯微光譜技術觀察酵母菌在巨噬細胞吞噬後之動態光譜變化。我們發現隨吞噬過程進行，酵母菌不飽和碳鏈相關的振動譜線，如 1651 cm-1 (C=C) 以及 1266 cm-1 (=CH)，其強度逐漸減弱。此結果與酵母菌脂質的過氧化 (lipid peroxidation) 反應吻合。此外，在細胞外施加活性氧化物 (氫氧自由基、次氯酸) 至酵母菌的對照實驗也發現有相似結果。而加入 NADPH 氧化酶抑制劑 – apocynin 後，此不飽和碳鏈振動譜線減弱的現象便不再發生。以上實驗結果均與上述解釋吻合。我們結合自體螢光成像及拉曼光譜技術成功觀察到巨噬細胞之活化及吞噬動態過程，也定量量測到巨噬細胞以活性氧化物為武器，氧化外來異物脂質。此方法之特色在於無需任何染色及細胞前處理便可對單一細胞之生理過程提供高解析度、動態及分子層次的訊息，也提供了一個新的定量白血球破壞能力之方法。我們預期相同技術未來亦可能進一步應用於研究活體動物 (living animal) 中之細胞過程 (cellular process)。