Trichoderma koningii G-39之β-木糖甘酵素之純化與性質研究

Abstract

木糖甘酵素(B-xylosidase)能將木糖寡醣(xylooligosaccharide) 或雙醣(xylobio se) 水解成木糖單糖(xylose)，是木聚糖(xylan) 水解系統中，一個很重要的酵素 。許多微生物都可以產生此一酵素，本實驗選擇Trichoderma koningii G-39 為菌 種，以木聚醣為唯一碳源時，木糖甘酵素可被誘導產生。本實驗純化出兩種木糖甘 酵素，木糖甘酵素I 利用陽離子交換管柱(SP-Trisacryl-M)及凝膠體層析管柱(Sep hadex G-100)純化。木糖甘酵素II則利用陰離子交換管柱(DEM及Mono Q) 純化，均 可達90% 以上純度。利用蛋白質電冰分析及凝膠體管柱層析，測得木糖甘酵素I 分 子量約54 kDa，木糖甘酵素II分子量約104 kDa ，兩者皆為單分子蛋白質。 木糖甘酵素1在25°C時，於pH2.25~pH6.8之間穩定度佳。木糖甘酵素II在37 °C時 ，於pH2.5~pH7.4 之間穩定度佳。木糖甘酵素I 對p-nitrophenyl-B-D-xylopyanos ide(PNXP) 之pH profile呈現鐘形曲線，由pK1=2.1 與pK2=5.1 所調控。其最通化 pH值於3.6~3.8 間。而木糖甘酵素II則在pH3.5~4.0 活性最大。木糖甘酵素I 對基 質有極佳之專一性，木糖甘酵素II則有較寬鬆之專一性，其對p-nitrophenyl-B-D- galactoside 及p-nitrophenyl-a-L-arobinoside 之活性約為PNXP之10% 。木糖甘 酵素I 對PNXP有很大之KM值，約於40~50mM 間，表示其對PNXP之結合力不強，而對 2,4-dinitrophenyl-B-D-xylopyranoside(2,4-DNXP)之結合力稍強(25。C,KM=24mM ) ，且kcat為PNXP之90倍。木糖甘酵素II對基質PNXP與2,4-DNXP卻有很強之結合力 (25°C KM 約0.05mM) ，而對2,4-DNXP之Kcat約為PNXP之2.5 倍。 在酵素表現方面，以木糖甘酵素I 之基因段pxyl，利用載體pet22b(+) 植入細菌BL 21中表現，利用不含peB Leader段之pet22b(+) ，則蛋白質表現於細胞質(cytosol ) 中; 而保留peB Leader段者將蛋白質引導至periplasma間，結果蛋白質以包涵體 (inclusion body)之慾呈現，但皆為無活性之酵素。