大腸桿菌thioredoxin G92突變對還原insulin的活性影響探討

Abstract

大腸桿菌thioredoxin為一分子量約11.7 kDa之多功能蛋白。主要是具有還原其他蛋白質的作用。Thioredoxin以Cys-32和Cys-35之間具有氧化還原活性的雙硫鍵作為活性中心。在活性中心周圍由Gly-33，Pro-34，Ile-75，Pro-76以及Val-91，Gly-92，Ala-93組成了一個疏水性平面，據推測可能與thioredoxin跟其他蛋白質的鍵結有關。因此本實驗就是以Gly-92位置突變的thioredoxin為主，希望藉由與insulin的作用對於這個位置帶來的影響有更清楚的了解。實驗中使用的thioredoxin包括野生株以及G92A、S、N、K、T、I等六種在Gly-92位置突變的蛋白質。經由DTT還原後和insulin作用，作用方式又分為含有DTT以及不含DTT的兩種條件。在含有DTT的條件下，G92A、N在沉澱生成速率上有比較快，是野生株的1.2倍。G92I則是比較慢，只有野生株的0.81倍。但若是比較沉澱開始生成時間，所有突變的蛋白質與野生株比較下都是延遲的結果。為了避免DTT存在可能的干擾，針對G92A、N、I這三個在含有DTT的反應下比較不同的突變蛋白質進行去除DTT後的反應。結果發現對insulin的反應性都增加，是野生株的2~3倍。其中差異最大的是G92I。因此推測在Gly-92位置的突變，對於還原態thioredoxin作用在Insulin的反應具有加速反應進行的影響，但對於氧化態thioredoxin還原成還原態造成干擾，所以才有沉澱生成速率有快有慢的現象發生。