以電化學法檢測人類乳突病毒序列之研究

Abstract

以電化學法去偵測病毒至今已有不少文獻被發表，這種方法具有不錯的敏感度、操作方便、容易得到訊號等優點。若是配合修飾電極表面，可使偵測的結果更加明確，並可提高偵測極限。本論文主要是利用6-Mercapto-1-hexanol(MCH)修飾電極，並將此電極用於分析在僅差幾個mismatch病毒檢測之應用。

實驗設計為針對子宮頸癌之高危險性人類乳突病毒(human Papillomavirus; HPV)16型(HPV type16)與18型(HPV type18)分別設計特定探針序列Probe16與Probe18，利用 溶液為設定之環境狀態，利用電化學法偵測這兩種家族間在 溶液中的氧化還原反應，如分離氧化還原波峰電位、兩波峰電流比值間比較等等。 在這實驗中，利用脫氧核糖核酸本身骨幹或雜交完後所帶的負電荷與存在水溶液中 離子產生靜電力排斥反應；或加入MB使脫氧核糖核酸呈電中性，配合其它的適當條件與方法，反應在電化學訊號進行偵測。

實驗中探討電極清洗、電解質種類、電解質濃度、電化學行為、 緩衝液pH值高低影響、單股種的時間、雜交時間、MB插入時間等參數，並探討如何去除非專一性吸附的干擾並提高雜交率。對於Probe16及Probe18序列在本實驗分開討論。

第一部份探討Probe16配合三種不同雜交股，分別為0、3、7錯位；本實驗所得之結果是利用含硫醇基單/雜交股種在金電極表面為工作電極，配合插入MB放大訊號之不同來比較。以循環伏安法從負電位的方向往正電位方向掃引，電解質為100mM的KNO3，搭配固定DNA種上去時間來探討脫氧核糖核酸在金電極上電化學行為。

第二部份探討Probe18配合三種不同雜交股，分別為0、4、6錯位，本實驗所得之結果是利用含硫醇基單/MCH/雜交股種在金電極表面為工作電極，，配合插入MB放大訊號之不同來比較。以循環伏安法從負電位的方向從正電位方向掃引。電解質為100mM的KNO3，搭配固定DNA種上去時間來探討脫氧核糖核酸在金電極上電化學行為，並與第一部份實驗數據比較之。

針對DNA感測器的結構進行各項檢測，電化學檢測電子傳輸情形(Cyclic Voltammetry)；DNA的覆蓋率與雜交率（Quartz Crystal Microbalance）；接觸角量測DNA的堆疊密度(Contact angle)，希望能藉此得到高鑑別率且穩定的鑑識技術，而利用亞甲基藍達到定性的功用，與QCM相互印證DNA覆蓋率。

由本研究之發現，綜合言之可列舉如下： 1. 金電極表面的乾淨度是影響DNA接和的最重要因素。 2. DNA緩衝液配置與種完單/雙股後清洗對於電化學訊號影響。 3. 在此實驗中，DNA之非特異性吸附會影響雙股間雜交率。 4. 次甲基藍對於雜交股DNA會有放大訊號功能。 5. 次甲基藍可放大效果可鑑別出同一家族中具有錯位之DNA。 6. 利用MCH當作單股DNA之間係物(spacer)，可有效提升雙股間雜交率至100%且避免非特異性吸附。 7. 經由QCM驗證，與其電化學量測結果是相互配合。