聚 唑啉/線性聚乙烯亞胺雙團聯共聚物製備奈米基因載體之研究

Abstract

本研究是以具酸鹼應答性及親水性之雙團聯共聚物poly(2-ethyl- 2-oxazoline)-block-poly(2-ethyl-2-oxazoline-co-ethylenimine)(PEOz-b- P(EOz-co-EI)) 作為基因載體。此雙團聯共聚物之P(EOz-co-EI) 鏈段為陽離子高分子，可與DNA經靜電作用結合成聚複合體(polyplex)；PEOz則提供酸鹼應答性及親水性，一方面藉由細胞內酸鹼值的變化，使聚複合體解離進而釋放DNA至細胞中，另一方面提高聚複合體的穩定性。在高分子之合成上首先以開環聚合得到末端帶有硫醇(sulfhydryl)之PEOz，再將PEOz水解後得到P(EOz-co-EI)，經由末端官能基之間形成雙硫鍵(disufide) 使此二高分子結合為雙團聯共聚物。同時利用不同分子量及水解比例之P(EOz-co-EI) 來探討雙團聯共聚物中P(EOz-co-EI) 鏈段對雙團聯共聚物所造成的影響。並和未導入PEOz之P(EOz-co-EI)與分枝聚乙烯亞胺(branched polyethylenimine, B-PEI) 作一比較。

實驗結果顯示B-PEI的高分子/基因重量比例 (P/D) 在1倍以上 能將DNA完全包覆，P(EOz-co-EI) 則需6倍以上，而雙團聯共聚物PEOz-b-P(EOz-co-EI) 在P/D比為8倍以上時能達到包覆效果。此外若P(EOz-co-EI) 之水解比例由76% 提高為89% 則P(EOz-co-EI) 或雙團聯共聚物包覆DNA所需要的P/D比可減少2倍。由粒徑分析得知雙團聯共聚物所製備的聚複合體大小約為200 nm，且不論是在純水或0.15M NaCl水溶液中皆沒有凝集的現象，反之B-PEI與P(EOz-co-EI) 聚複合體在0.15M NaCl的環境下會凝集成大顆粒。從界面電位的分析中，得到B-PEI與P(EOz-co-EI) 聚複合體之表面電荷會因P/D比的增加而從陰離子轉變為陽離子，然而PEOz-b-P(EOz-co-EI) 聚複合體在達到特定P/D比之後即維持電中性。將PEOz-b-P(EOz-co-EI) 聚複合體分別置於pH 4.5到pH 7的緩衝溶液中測試其對酸鹼的應答性，經由電泳分析後得知P(EOz-co-EI) 鏈段分子量為5000或5700之聚複合體在pH 5.5以下的酸性環境中會解離並釋放DNA，若P(EOz-co-EI) 鏈段之分子量增加為8600或9700，則在pH 5.5時聚複合體不會解離。

由細胞毒性的試驗中得知在高分子濃度為10 mg/ml時，B-PEI與P(EOz-co-EI) 之細胞存活率分別為7% 和30% ，雙團聯共聚物則有60% 的存活率，此外高分子中P(EOz-co-EI) 鏈段之水解比例由76% 提高為89% 或分子量由5700增加為9700，皆會降低約10~20%的細胞存活率。在細胞轉染上B-PEI及水解比例為88% 或89% 的P(EOz-co-EI) 聚複合體皆能使細胞表現螢光基因，其發光強度約在6000~8000，於酸鹼應答性試驗中能在pH 5.5下解離的PEOz-b-P(EOz-co-EI) 聚複合體有約3000~6000的發光強度，而相對應之P(EOz-co-EI) 聚複合體也約在3000~6000，反之不會解離的聚複合體之發光強度約為2000~4000，但相對應之P(EOz-co-EI) 則有3000~7000的發光強度。

綜合以上的實驗結果，雙團聯共聚物PEOz-b-P(EOz-co-EI) 相較於P(EOz-co-EI)，不僅細胞毒性更低，所形成的聚複合體較為穩定，且在具酸鹼應答的特性下能保有與P(EOz-co-EI) 相當的細胞轉染能力，因此本研究所合成之雙團聯共聚物為優良的陽離子高分子基因載體，故具有應用在基因治療的潛力。