建構長鏈寡核苷酸晶片用於人類乳突病毒的檢測與分型

Abstract

人類乳突病毒（human papillomavirus; HPV）是一全長約8 kb的雙股環形DNA病毒，其亞型超過一百種，其中約有35種亞型會感染人類生殖器官。子宮頸癌是婦女第二大癌症，目前HPV的感染被認為是造成子宮頸上皮細胞病變的最主要因子，因此子宮頸的HPV感染之檢測極為重要，而本研究目的即在建立一可信度高的HPV檢測與分型之方法。 我們將83種HPV亞型的基因組依各基因片段進行系統性的序列比對分析，我們根據各序列彼此間的「相似/相異/相似」規則，在45種HPV亞型的L1和E1基因區段中分別找出一個特定區域（大約90-120 bp），此區域在中心部分（大約50-70 bp）為一變異性高的序列，而其二端則分別為高度保留性序列（20-25 bp）。我們依據每個特定區域中的高度保留性序列設計一universal引子對，也在此引子對中間的高度變異性序列設計了45個特定探針(50-mer oligonucleotide)，因此共有90個50-mer oligonucleotide探針被設計與合成，並將之點置於玻璃晶片上，構成我們所謂的HPV chip，而所合成的90個探針序列，彼此間之差異性均大於10% (相當於5 bp)。每片HPV chip包含二個重複探針矩陣（matrix），每個矩陣含有可檢測45種HPV亞型的特定探針，並安置有internal、positive及negative等control序列。在HPV chip的檢測試驗中，由子宮頸取得的黏膜組織先萃取其總DNA（total DNA），再利用universal的引子對在加入螢光Cy3或Cy5標誌核□酸的反應液中經聚合□鏈鎖反應（polymerase chain reaction; PCR）作用，可獲得螢光標定HPV E1或HPV L1特定DNA片段，此DNA片段再與HPV chip進行DNA雜交作用後，以螢光雷射掃描器掃描以獲得檢測結果。在HPV chip的檢測中，對於特定之檢測標的序列，在其對應的探針點上所呈現的螢光強度均顯著高於negative control和其他探針點的螢光強度。我們利用TaqMan real-time PCR技術的檢測結果來計算我們的HPV Chip檢測之正確性（accuracy）與敏感性（sensitivity）。在122個子宮頸黏膜樣本檢測中，HPV Chip對於HPV 18亞型檢測的正確性與敏感性分別為95%與90%。另一方面，我們也運用PCR-限制□片段多型性（restriction fragment length polymorphism; RFLP）技術針對HPV E1的特定DNA片段進行分析，結果顯示運用PCR- RFLP、TaqMan real-time PCR及HPV chip在高危險性HPV檢測上可靠度很高，特別是運用在HPV 16 和HPV 18的檢測。 本研究中我們根據生物資訊的運算，建構一可用於HPV檢測與分型的長鏈核□酸晶片，並證明本晶片用於HPV的檢測具有高度準確性和可靠性。本研究所建立的HPV檢測方法與策略，可作為未來發展臨床上HPV檢測與分型更佳技術的參考。不過，我們所建構的HPV Chip離真正要在臨床上的運用，還需要更多的改進與修正。