荔枝褐化酵素(PPO)結構與保鮮之應用

Abstract

樹上的荔枝呈現的是豔麗的鮮紅色，一旦採收後2-3之內逐褐化而失去口感(圖九)。荔枝褐變問題一直都是降低其產值的重要問題。若是能保持鮮豔顏色以及維持品質，並能夠延長採收後的存放時間，將對荔枝之量產及價格穩定有所助益。造成荔枝快速褐化是由於內生性之多酚氧化酶(PPO)產生黑色素(quinones)之代謝產物所致。PPO是一種含銅的多酚氧化酶(E. C. 1. 14. 18. 1)，主要是將酚類 (phenol) 氧化成二酚類(diphenol)，更近一步的變成quinones，後者是一種不溶於水的褐色聚合物，在植物中造成褐化最主要原因，然而在人類皮膚則產生黑色素 (melanin)。本實驗室已成功純化出造成荔枝褐化的兩個PPO酵素(圖二,三)。研究顯示，純化後之荔枝氧化酶其活性與其他蔬果類相似，affinity(Km)約在2-10 mM左右(圖四)。荔枝褐化原因有： (1) 採收後抑制劑(PPO inhibitor)逐漸揮發而失去抑制PPO氧化酶的能力而形成黑色素(圖十)。 (2) 採收後水份散失增加了氧與PPO的接觸機會，同時失去了水份阻擋揮發性抑制劑的揮發的功能，此兩效應都增加了褐變反應的速率(圖八)。 (3) 採收後水份散失也造成荔枝表面結構逐漸改變破壞，藉由電子顯微鏡(SEM)觀察其平滑的表面，變成孔洞狀的結構(圖七)，使得PPO與空氣接的接觸面積大大提高(圖六)，增加褐化的速度。研究抑制劑對荔枝的PPO的抑制機制並在短時間內研發防褐化方法。將有助於加長收穫後的口感及保存、延長銷售時間，並突破外銷褐變之限制，更能全面的增加農業的產值。因而本實驗室提出在短期間內完成荔枝保鮮法的計畫。 1. 抑制劑分子的純化及鑑定。將多元組成內生性的揮發性小分子抑制劑純化成個別分子並以氣相層析質譜儀(GC-MS)建立其分子結構。 2. 比較抑制效果最強的抑制分子。純化出抑制最佳的分子之後，據以由人工合成的方式，嘗試大量製造。 3. 用人工合成的方法將揮發性抑制劑修飾成不具揮發性。揮發性抑制劑不利收穫後產銷，保存的應用。因此，化學修飾使其變成不具揮發性的類似物抑制劑是必須的。 4. 果臘的塗抹技術的研發。從荔枝褐化過程中表皮結構變化的研究顯示，保濕對褐化的延遲有決定性的貢獻。因此，再採收後的果子表皮能塗上一層食臘將對其保鮮有所助益。 5. 測試製備的抑制劑對防治荔枝褐變的效果。實際應用在採收後的荔枝。抑制劑塗裹的方式、效率、保存的時間。保鮮的時間，預期在外銷時加上船運的時間，到消費者手中時仍然是有如剛離枝荔枝的鮮艷。 6. 儲運到消費者手中的時間，防止腐敗及細菌生長的效果。模擬保鮮處理後，儲運的時間、環境、過程，達成不發霉長菌的條件。我們提出有一種揮發性的抑制劑存在動植物內，此種抑制劑會抑制生物體內PPO的活性。荔枝在收成後，揮發性的抑制劑逐漸消失，導致內生性的PPO活性逐漸上升，因此荔枝便會產生深黑褐色的表面褐化。在本研究中，我們以荔枝作為防褐化標的，以生化酵素動力實驗、部分純化黑色素抑制劑來解釋揮發性抑制劑在植物體內的存在及其作用，更進一步對荔枝快速褐化提出一種新的理論。研究發現PPO的褐化反應就像是人體內酪氨酸酶(tyrosinase)的催化反應，酪氨酸酶可以使人體產生黑色素而累積在皮膚上形成黑斑，利用〝人工皮膚〞模擬揮發性黑色素抑制物的作用，證明，防止PPO抑制劑之揮發或修飾使其不揮發保留在荔枝表面，可以在未來荔枝外銷保鮮扮演決定的角色。

Polyphenol oxidase (PPO) is a copper-containing enzyme that catalyzes the chain-oxidation from monophenol or polyphenols to o-diphenols and subsequent o-quinones. The enzyme reflects the browning reaction in fruits. In the present study, we investigated the oxidation activity of PPO in litchi pericarp and the mechanism by which PPO instantly makes pericarp browning. PPO of litchi pericarp was initially extracted and isolated through gel filtration chromatography and then eluted directly from SDS-PAGE. Two molecular forms of litchi PPO were identified as 86 and 66 kDa, and thereafter named as PPO-86 and PPO-66, respectively. The Km and Vmax were determined as 66 mM and 382 mM/min for PPO-86 and 102 mM and 290 mM/min for PPO-66, respectively. Most importantly, PPO-86 could trigger the 3,3'-diaminobenzidine and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) oxidation, which was not found in other plant PPO. Thus, the unique PPO activity of litchi might account for its superior rapid-browning reaction. In addition, we show the presence of a potent volatile inhibitor(s) for PPO in litchi pericarp. The surface of post-harvesting litchi pericarp revealed an opening ultra structure under the scanning electron macroscopic examination, therefore allowing an instant evaporation of PPO inhibitor. As such, the PPO oxidation was proceeded. The novel finding clarifies the mechanism involved in the rapid browning phenomenon of post-harvesting litchi pericarp. The finding of evaporation of potent PPO inhibitor may be potentially used as a strategy in developing a novel method for preventing litchi browing.