人類 Alpha-L-岩藻醣甘酵素之結構與催化機構的研究(I)

Abstract

人類α-L-巖藻糖..(α-L-fucosidase，簡稱hAFU)，可分解L-巖藻糖多 醣體、醣蛋白、醣脂類等。缺乏此酵素會引起巖藻糖累積症(Fucosidosis)而 逐漸導致神經傳導疾病。hAFU 在許多轉移性癌症中，活性有明顯升高的 現象，臨床上已被用來作為檢驗肝癌的標定物，和胎兒球蛋白(AFP)聯合偵 測可將肝癌診斷準確率提升至93%以上。諸多研究亦顯示此酵素之活性變 化與多種癌症手術後復發率有密切關係。此外，巖藻醣甘酵素被發現亦存 在於精液中和精子之漿膜上(plasma membrane)，可能與精卵之結合有關， 這些都顯示巖藻醣甘酵素在生理上可能扮演著相當重要的角色。目前對人 類巖藻醣甘酵素研究仍相當有限，可能的原因之一是其原始酵素(Native) enzyme)不易取得，又活性穩定的重組酵素表現和純化不易。本研究室已於 兩年前對此酵素進行先期研究並克服了表現該酵素的困難。此外在受質的 合成上亦突破了1,2-cis 之醣甘類的合成瓶頸，已可有效多量合成相關反應 受質甚或抑制劑以供本研究使用。 巖藻醣甘酵素屬於第29 家族醣類水解酵素(family GH29)成員，此族酵 素目前唯一的蛋白質晶體結構為Thermotoga maritime(細菌)的酵素，雖同屬 family29 但其催化性質和胺基酸相似度均與人類酵素差異頗大，預判蛋白質 結構亦會不同，由於它與人類疾病的緊密關係和對受孕的可能影響，使得 對此酵素的基礎研究更具意義。 本計畫為期兩年，將對此人類酵素之蛋白質結構進行模擬和晶體結構解 析，並依胺基酸比對以定點突變技術研究其重要殘基，利用活性位置抑制 劑標示法結合質譜之勝.定序技術以鑑定此酵素之親核性和一般酸/鹼胺基 酸的確切位置。藉由動力學研究和酵素抑製作用以深入探討酵素之催化機 構，進而達成有效的藥物設計。有效的抑制劑藥物可用以發展化學chaperone 治療法、高特異性之α-L-巖藻糖..檢測、親和性分離基材等。 二年內待完成的工作分列如下： 第一年: (1) 反應受質之合成 (2) 酵素純化與性質研究 (3) 突變酵素與活性分析 (4) 酵素動力學研究與反應機構 第二年: (1)親和抑制劑之合成 (2)酵素動力學研究與反應機構 (3)酵素結構模擬與晶體結構 (4)質譜之勝.定序與重要殘基鑑定