利用氧化鯊烯環化酵素作為篩選胜﹝月太﹞適合體及其擬胜﹝月太﹞之研究(I)

Abstract

氧化鯊烯環化酵素為負責催化哺乳類中之膽固醇與黴菌中之麥角脂醇生合成 途徑中共同中間產物，羊毛脂醇，之合成。另外、在植物中氧化鯊烯環化酵素利 用相同之受質，(3S)-2,3-氧化鯊烯，以生合成環阿屯醇作為植物脂醇生合成之前 驅物。這一酵素由於其可作為調控哺乳動物之膽固醇、黴菌之麥角脂醇及植物脂 醇二級代謝物之生合成，進而影響血液中膽固醇濃度之高低、黴菌及病原性微生 物如錐蟲之複製生長、及植物脂醇代謝物之生合成、因而廣泛被作為有效發展抗 原蟲、抗黴菌、及降低膽固醇藥物之重要標的。 而在化學及生化轉化酵素所催化的反應中，以氧化鯊烯環化酵素為代表的環 化、重組及氧化反應以生成三.類化合物，可一步催化最少十個共價鍵之斷裂及 十個共價鍵之形成，將非環狀反應物催化形成多環狀產物，並產生最少六個立體 中心，因而成為自然界中最複雜與吸引人之生物轉化反應之一。另外，此類酵素 所催化反應之產物具有結構之多樣性，目前已有超過90 種以上以C30H50O 為其 分子式之三.類化合物是經由氧化鯊烯環化之途徑所獲得。 近年來對於氧化鯊烯環化酵素之研究主要集中於對於氧化鯊烯環化酵素之結 構-功能-作用機制關係之探討，及其作為開發抗黴菌或降低膽固醇藥物之基礎平 台。本實驗室經由利用隨意突變與導向演化之篩選策略，成功的改變氧化鯊烯環 化酵素之產物專一性與部份解構其負責之酵素活性胺基酸，確認出可能負責受質 進入酵素活性區域之途徑及負責其A 環環化反應之穩定作用的環狀區域，此一 區域可能對所有之環化酵素均扮演極重要之角色。另外亦經由定點突變之產物分 析，成功分離出部份重組之中間產物，確認其反應中間物及其相對應負責之胺基 酸序列。 對於以氧化鯊烯環化酵素作為藥物開發之標的及增進對氧化鯊烯環化酵素之 結構-功能-作用機制關係的瞭解，我們已突破以往不易獲得乾淨單一純化酵素的 瓶頸，成功的由牛肝中純化出一在銀染之下為單一蛋白質之牛肝氧化鯊烯環化酵 素，未來我們將以所純化之牛肝氧化鯊烯環化酵素，作為篩選抗黴菌或降低膽固 醇藥物之基礎平台。我們將以勝.作為篩選材料，建構噬菌體表現勝.庫及奈米 粒子共軛之隨意勝.庫，利用親和力遞增之交互作用篩選出可與氧化鯊烯環化酵 素作用之勝.序列。所篩選出來之勝.將進一步合成確定序列之多勝.，確認其 交互作用強度與專一性。將利用表面電漿共振之即時反應偵測以進行其鍵結動力 學與專一性，另外亦將利用核磁共振與超快飛秒分子雷射等分析工具，以測定其 鍵結能力、反應機制、及結構-抑製作用關係之探討。而所獲得具有親和能力之 勝.序列將進一步以修飾勝.、非勝.類似物等擬勝.進行改良以提高其親和力 及專一性，以在將來作為前導藥物之設計及合成。 因此，本計畫在未來三年之研究工作目標將分為以下數項： 1．純化足量之氧化鯊烯環化酵素以作為蛋白質-勝.交互作用之研究。 2．免疫產生氧化鯊烯環化酵素之單株抗體以作為篩選勝.適合體之用。 3．建構噬菌體勝.庫及利用親和力篩選策略篩選與氧化鯊烯環化酵素有交互作 用之勝.適合體。 4．合成七胺基酸之隨意組合式勝.庫並將其共軛鍵結於奈米金粒子以進行氧化 鯊烯環化酵素之組合勝.適合體之篩選。 5．測定與氧化鯊烯環化酵素作用之勝.適合體之胺基酸序列。 6．利用表面電漿共振之即時反應偵測以測定勝.適合體之結合及解離常數與專 一性。 7．利用核磁共振測定氧化鯊烯環化酵素-勝.適合體之結構-抑製作用關係。 8．利用超快飛秒分子雷射測定氧化鯊烯環化酵素-勝.適合體之結合對環化機 制中碳陽離子之轉移機制。 9．設計及合成修飾勝.或非勝.類似物等擬勝.進行改良以提高其親和力、專 一性或穩定度，以在將來作為前導藥物之設計及合成。 本計畫之執行，對於氧化鯊烯環化酵素之結構-功能-作用機制之關係及可能 之勝.作為降低膽固醇及抗黴菌藥物之研究，將可有進一步之瞭解，並可提供作 為未來設計可與氧化鯊烯環化酵素有親和作用之適合體以作為藥物開發及生物 科技應用之基礎。