利用氧化鯊烯環化酵素作為篩選胜太/核酸Aptamer之研究

Abstract

病原性微生物如錐蟲和白色念珠菌對於人類，尤其是第三世界國家及愛滋病 人，之健康已造成嚴重威脅。然而目前用於治療這些疾病之藥物常因其藥物毒 性，有效性及抗藥性而降低其效果或限制其使用。另一方面，心臟血管疾病之發 生與血液中膽固醇濃度之高低存在密切關係，因此發展降膽固醇藥物將對預防心 臟血管疾病有極大助益。 脂醇和三帖類化合物之生合成途徑廣泛存在於生物體內，為有效發展抗原 蟲、抗黴菌、及降低膽固醇藥物之重要標的。氧化鯊烯環化酵素為脂醇和三帖類 化合物之生合成途徑中之重要酵素，負責催化(3S)-2,3-氧化鯊烯之環化、重組及 氧化反應，以在黴菌及哺乳類中生成羊毛脂醇，在植物中生成環阿屯醇。另外， 目前已有超過90 種以上以C30H50O 為其分子式之三帖類化合物是經由氧化鯊烯 環化之途徑所催化。 過去對氧化鯊烯環化酵素所催化之反應途徑及機制由於不易純化其酵素而無 法作進一步之研究。本實驗室先前對氧化鯊烯環化酵素利用隨意突變與導向演化 之篩選策略，成功的改變酵素之產物專一性與解構其負責之酵素活性氨基酸，並 利用此一成果進一步確認出可能負責其受質進入酵素活性區域之途徑及負責其 A 環環化反應之穩定作用的環狀區域，此一區域可能對所有之環化酵素均扮演極 重要之角色。另外，本實驗室以牛肝為氧化鯊烯環化酵素純化之來源，成功突破 過去不易獲得乾淨單一純化酵素的瓶頸，獲得一在銀染之下為單一蛋白質之牛肝 氧化鯊烯環化酵素，這一結果將可進一步作為瞭解酵素之結構與功能關係或開發 以氧化鯊烯環化酵素為標的之抗黴菌或降低膽固醇藥物之基礎平台。 為了進一步延伸抗氧化鯊烯環化酵素之藥物開發及增進對氧化鯊烯環化酵素 之結構-功能關係的瞭解，我們採用組合式之策略以篩選能和氧化鯊烯環化酵素 有親和力及專一性之核酸及生太作為前導藥物之標的。我們將利用光誘發反應配 位體指數遞增演化以篩選可與標的作用之核酸序列。我們也將建構二個隨意生太 庫以篩選可和氧化鯊烯環化酵素作用之生太序列，並利用分子交互作用系統、超 快飛秒分子雷射及核磁共振等方法進行鍵結能力、結構及分子動力模擬等動力學 測試。最後所獲得之生太序列將進一步以修飾生太或非生太類似物進行改良以提 高其親和力及專一性，以在將來作為前導藥物之設計及合成。 因此，本計畫在未來三年之研究目標將分為以下數項： 1．純化足量之氧化鯊烯環化酵素以作為蛋白質-核酸及蛋白質-生太交互作用之 研究。 2．設計及合成寡核酸探針並進行氧化鯊烯環化酵素之光誘發反應配位體指數遞增與聚合脢連鎖反應放大。 3．氧化鯊烯環化酵素之蛋白質-核酸膠體遲滯電泳分析，寡核酸序列之選殖、定 序、及結構與鍵結常數測定。 4．建構噬菌體生太庫及利用演化策略篩選氧化鯊烯環化酵素-生太aptamers 5．合成七氨基酸之組合式生太庫及利用半合理策略篩選氧化鯊烯環化酵素-生 太aptamers 6．測定與氧化鯊烯環化酵素作用之生太aptamers 之氨基酸序列。 7．利用不同生物物理方法進行氧化鯊烯環化酵素-生太aptamers 之鍵結能力、 結構及分子動力模擬等動力學測定。 8．設計及合成第二個含修飾或非生太類似物之生太庫以提高其親和力及專一 性，作為將來前導藥物之模板。 本計畫之執行，對開發以氧化鯊烯環化酵素為標的之降低膽固醇及抗黴菌藥 物之研究將提供一核酸及生太藥物之新選擇，並對酵素之結構-功能關係的探討 有進一步之瞭解，並可提供作為未來設計可與氧化鯊烯環化酵素有親和作用之 aptamers 以作為製藥及生物科技應用之基礎。