食品與飼料組成分中動物種源鑑別DNA快速檢驗法之建立及其應用

Abstract

食物與飼料組成份中肉源種類鑑別對於防疫工作的進行非常重要，同時對某些地區因保障動物權或因宗教信仰禁止食用部分動物，也得依賴肉源鑑別技術來協助法令的執行。近年來，由於消費者擔心由狂牛症疫區所販售製品中混雜有牛肉，此更使食物與飼料中肉源種類鑑別工作更顯重要。根據過去十年來的研究成果已知，以DNA為檢驗標的物（target）較蛋白質為佳，此乃DNA即使經過高度嚴苛加工程序（例如高溫處理），仍能保持其穩定性，且在一動物個體中任一組織的DNA組成皆相同。以DNA為基礎的動物種源檢測原理為測定各種動物細胞中存在的特定且專一的序列。本計畫中，我們將結合生物資訊與分子檢測技術研發可用於鑑別與定量動物種源的方法，我們預期進行所謂「計算選取粒線體DNA放大指紋法（Computer-Aided Selection mitochondrial DNA Amplification Fingerprinting）」（第一年）與 DNA晶片（第二年）兩項研究工作，這兩項策略的檢測標的DNA皆為mtDNA，此乃細胞中mtDNA具有分子數多、物種間序列差異性大與容易萃取及檢測的特性。在Selection mitochondrial DNA Amplification Fingerprinting研究策略中，各畜禽的mtDNA D-loop序列將被用來作為種源專一性引子（primer）設計的依據，這些引子會被組合成引子組（primer set）用於在一次偵測反應中，此為利用最少的引子數可同時在食品或飼料中檢測多種物種的方法。在本方法中，標的mtDNA D-loop片段在PCR反應擴增過程中加入螢光標誌物，並以毛細管電泳技術分析之。在DNA晶片研究策略中，我們預期由至少20種動物的mtDNA D-loop與cytochrome b序列之高度保留區及高度差異區中，設計出可用於分示這些動物種源20-25 bp的oligonucleotide約100段。這些oligonucleotides探針序列將被點置於玻璃晶片上，並與經螢光物質Cy3或Cy5標誌之標的DNA進行雜交，DNA晶片雜交結果所呈現的態樣（pattern）便可作為標的物中含有的動物種源檢測。運用我們所將建立的兩種方法，預期可由一含有混合肉的食物或飼料中檢驗出多重特定的動物物種組成，且計畫目標使之成為可定量之技術，而期望的定量底限為1%以下。