台灣本土性魚類(苦花)雌性激素受體基因選殖與環境荷爾蒙干擾效應研究

Abstract

本研究利用逆轉錄-聚合連鎖反應(RT-PCR)及cDNA末端快速擴增技術(RACE)從苦花(Varicorhinus barbatulus)肝臟選殖並定序出三條雌性激素受體基因全長，並送至Genbank/EMBL資料庫註冊，分別命名為vbER□(AJ547632)、vbER□1(AJ314603)、vbER□2(AJ547633)，經序列比對(sequence alignment)及親源分析(phylogenetic tree)確定苦花ER與鯉形目(Cypriniformes) 的親源關係最親近，在演化上vbER□的C功能區(C domain)演化比其他鯉形目魚類慢，而其他功能區則演化較快。另外將vbER□及vbER□1基因全長剪接至pGAD424表現載體，且將三重複雌性激素反應序列(estrogen response element; ERE)剪接到□-半乳糖脢啟動子上，再轉殖到酵母菌中(YM4271)，篩選具活性的菌種來偵測化合物的轉錄活化能力，藉由濃度反應關係圖，可以計算出化合物的配位體效力(ligand potency,或稱為EC50)及配位體效能(ligand efficiency)，在11種測試物中，天然雌激素(17□-estradiol)及三種酚類衍生物即4-nonylphenol(4-NP)、4-t-optylphenol(4-t-OP)、bisphenol A(BPA)有明顯的濃度反應關係，以E2為標準進行常態化(normalize)，可得四種化合物對vbER□轉殖酵母菌的相對效力(relative potency)及效能(relative efficiency)皆高於vbER□1轉殖酵母菌。而與人類或彩虹鱒ER轉殖酵母菌進行比較，本實驗建構之轉殖酵母菌更為敏感。另外4-NP及4-t-OP對兩種轉殖酵母菌的相對效力相差1.4~2.6倍，但BPA卻有12.8倍的差異，故存在受測物之選擇性，結果顯示建構的重組酵母菌可作為類雌激素的體外篩選實驗。本研究亦利用特定引子(primer)搭配RT-PCR反應來獲得各雌性激素受體在苦花組織的基因表現，結果vbER□與vbER□1在肝臟的表現量最高，而vbER□2則在腸表現量最高。本研究證明以PCR進行基因選殖是可行的，此外親緣關係及分子結構分析亦符合其他魚類ER相關的演化推論及蛋白質功能。