Purification and Characterization of β-Xyiosidase from Trichoderma koningii G-39

Abstract

木糖甘酵素( β-xylosidase)能將木糖寡醣(xylooligosaccharide) 或雙醣 (xylobiose) 水解成木糖單糖(xylose)，是木聚糖(xylan) 水解系統中，一個很重要 的酵素。許多微生物都可以產生此一酵素，本實驗選擇Trichoderma koningii G-39 為菌種，以木聚醣為唯一碳源時，木糖甘酵素可被誘導產生。本實驗純化出兩種木糖 甘酵素，木糖甘酵素Ⅰ利用陽離子交換管柱(SP-Trisacryl-M)及凝膠體層析管柱 (Sephadex G-100)純化。木糖甘酵素Ⅱ則利用陰離子交換管柱(DEAE 及Mono Q) 純化 ，均可達90% 以上純度。利用蛋白質電泳分析及凝膠體管柱層析，測得木糖甘酵素Ⅰ 分子量約54kDa ，木糖甘酵素Ⅱ分子量約104 kDa ，兩者皆為單分子蛋白質。 糖甘酵素Ⅰ在25℃時，於pH2.25~pH6.8之間穩定度佳。木糖甘酵素Ⅱ在37℃時，於pH 2.5~pH7.4 之間穩定度佳。木糖甘酵素Ⅰ對P-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside (PNXP)之pH profile呈現鐘形曲線，由pK1=2.1 與pK2=5.1 所調控。其最適化pH值於 3.6~3.8 間。而木糖甘酵素Ⅱ則在pH3.5~4.0 活性最大。木糖甘酵素Ⅰ對基質有極佳 之專一性，木糖甘酵素Ⅱ則有較寬鬆之專一性，其對p-nitrophenyl-β-D- galactoside 及p-nitrophenyl-α-L-arobinoside之活性約為PNXP之10% 。木糖甘酵 素Ⅰ對PNXP有很大之KM值，約於40~50mM 間，表示其對PNXP之結合力不強，而對2,4- dinitrophenyl-β-D-xylopyranoside(2,4-CNXP) 之結合力稍強(25 ℃，KM=24mM)， 且Kcat為PNXP之90倍。木糖甘酵素Ⅱ對基質DNXP之Kcat約為PNXP之2.5 倍。 而酵素表現表面，以木糖甘酵素Ⅰ之基因段pxyl，利用載體pet22b(+) 植入細菌BL21 中表現，利用不含pelB Leader 段之pet22b(+) ，則蛋白質表現於細胞質(cytosol) 中；而保留pelB Leader 段者將蛋白質引導至periplasma間，結果蛋白質以包涵體 (inclusion body) 之態呈現，但皆為無活性之酵素。