細胞生長速率與供氧量對大腸桿菌延胡索酵素及基因表現之研究：

Abstract

延胡索酸酵素 (fumarase) 為三羧酸循環 (tricaboxylic acid cycle， TCA cycle) 中重要之酵素，其功能是催化延胡索酸 (fumarate) 與蘋果 酸 (malate) 之間的轉換。目前已知延胡索酸酵素含有三種不同的基因， 分別為 fumA，fumB 及 fumC。fumA 與 fumB 基因的序列很相似，它們所 生成的延胡索酸酵素為熱不安定性 (heat labile)，其蛋白質含有鐵硫活 性中心。而 FumC 酵素 則為熱安定 (heat stable)，其酵素活性反應無 需鐵離子參與，而且 fumC 基因的表現會受 superoxide (O2-) 誘發。 為了研究高供氧量及無氧時，細胞內延胡索酸酵素活性及其基因表現與生 長速率的關係，我們利用分批式培養法及化學恆定 (chemostat) 連續式 培養法來控制細胞的生長速率，以探討不同供氧量及不同生長速率下延胡 索酸酵素受調控的情形。由實驗結果發現，生長速率與酵素活性的關係在 批式培養時，生長速率愈快，延胡索酸酵素的活性愈低，生長速率變慢， 延胡索酸酵素的活性則上升。在連續式培養中，我們發現改變細胞生長速 率後，延胡索酸酵素的活性會隨生長速率的下降而增加。如果我們考慮供 氧的情形，則更進一步發現，高供氧時，FumC 酵素活性受生長速率調當 我們控制細胞的生長速率由慢變快，並分別抽取細胞在不同生長速率下的 總 RNA，然後進行北方墨點轉印分析，結果顯示，fumA 及 fumC 基因所 產生的 mRNA 隨生長速率的上升而產量均下降。而且 fumA 及 fumC 的 mRNA 產量都是以 acetate 為碳源時高於 glucose 為碳源。同樣地，此 兩基因之 mRNA 在高供氧量下又比無氧時高，此結果表示 fumA 及 fumC 基因的表現，在 DNA 轉錄為 mRNA (transcriptional level) 步驟受生 長速率、碳源及供氧量影響。由上述實驗結果使我們繼續探討 fumA 及 fumC 基因在不同生長速率及碳源下 mRNA 之穩定性。利用 rifampin 抑 制 D Escherichia coli contains three biochemically distinct fumarases to catalyze the interconversion of fumarate to L-malate in the tricarboxylic acid (TCA) cycle. While the fumA and fumB genes encode heat-labile, iron-containing fumarases, the fumC gene product is a heat-stable fumarase which does not require iron for activity. It has been reported that synthesis of FumC increased with the addition of oxidizing agents, and this increase was assumed to be dependent upon the soxRS gene products. To study how the