黃質菌中 Catalase-Peroxidase 之純化與性質研究

Abstract

本研究自Gram-negative Flavobacterium meningosepticum的細菌中純化出一種具有catalase (EC 1.11.1.6) 與peroxidase (EC 1.11.1.7) 雙重活性之□。其細胞粗提取液經 40-50 % 硫酸銨沉澱、 DEAE chromatography 、 Hitrap Q chromatography and Phenyl-Sepharose chromatography 等管柱純化後，可得到 90 % 以上純度的 catalase-peroxidase ，經蛋白質電泳鑑定其分子量為 63 kDa ，又經 G-200凝膠體管柱層析鑑定為 128 kDa ，故是一雙聚體分子 (dimer) 。 在可測量的範圍內，最適合的 pH 值範圍 7.0-10.0，pH 值介於7.0-10.0之間的穩定度較佳，活性不受溫度的影響，但很特別的是酵素以50 ℃、60 ℃ 熱處理時，60分鐘後，活性仍能維持穩定。 金屬離子中只有 Cu2+ 對酵素有些許影響，其餘的金屬離子和EDTA 對酵素的影響不明顯，而酵素活性隨鹽類濃度增加而下降。 酵素在波長 406 nm 有一吸收波峰，顯示有 protoheme 的輔□存在。酵素有較高的 catalase activity ，其對 H2O2 的 Km 值為 41.5 mM ；而由 peroxidase 的活性測試顯示：其對反應基質substrate有特異性，僅催化 pyrogallol ， Km 值為 2.92 mM 。 以 catalase 的專一抑制劑 3-amino-1,2,4-triazole 測試我們所純化的酵素，發現此酵素不受 3-amino-1,2,4-triazole 的抑制，但仍會被 NaN3 所抑制，此與一般 catalase 之性質不同。

A catalase-peroxidase was purified to at least 90% homogeneity from Flavobacterium meningosepticum. The purification involved a series of chromatographic separations on DEAE, HiTrap Q, and phenyl-sepharose columns. The purified enzyme is a dimeric protein with a Mr value of 63 and 128 kDa estimated by SDS-PAGE and gel filtration, respectively. The UV spectrum of the enzyme demonstrates a distinct absorption band withλmax = 406 nm indicating a protoheme present. This enzyme is stable in pH 7 - 10 and posses a pH optimum in this range. Interestingly, it exhibits an unusual thermostability in 50 - 60 ℃. When enzyme was assayed as peroxidase activity, pyrogallol is the only effective substrate with Km = 2.92 mM. The Km value of H2O2 is 41.5 mM when the enzyme functions as catalase. Divalent metal ions, with the exception of Cu2+, and EDTA have no significant effect on catalase activity. 3-amino-1,2,4-triazole, a specific catalase inhibitor, displayed negligible inhibition on the purified enzyme while NaN3 remained effective.