大腸桿菌Thioredoxin reductase的活性與連接兩個功能次單元的beta-sheet結構之關係

Abstract

大腸桿菌的Thioredoxin reductase是屬於黃質酵素中的pyridine nucleotide-disulfide oxidoreductase家族中的一員。此酵素為一個同型二聚體的蛋白質，每個單體分子量為35300道爾吞，分別包含了一個活性中心和輔基FAD，其催化的反應是利用NADPH將thioredoxin這個小蛋白質還原，電子傳遞的過程是由NADPH到FAD，再由還原態的FAD到thioredoxin reductase的活性中心，最後由此活性中心形成的dithiol和thioredoxin的雙硫鍵作用將它還原。從Thioredoxin reductase的結晶結構可看到此蛋白由兩個球狀次單元組成，且經由一個β-sheet結構所連接，其中，一個次單元含有一個輔基FAD，另一個次單元含有NADPH的結合位置與活性中心。當電子傳遞進行時，會有一個構形的轉變的發生：兩個次單元互相扭轉了66∘。而構形的改變需要一個旋轉的轉軸，即為連接兩個次單元的β-sheet結構，從文獻上已知Thioredoxin reductase構形的改變對其催化路徑是重要的，而我們推測β-sheet結構對其活性亦扮演關鍵性的角色。於是我們利用定點突變的方式改變此結構及靠近此結構的胺基酸，再測整體酵素的活性（Km及kcat值）。我們發現此結構上的突變對於整體活性的影響是顯而易見的，所以我們相信此β-sheet結構的確在大腸桿菌Thioredoxin reductase的催化路徑中扮演重要的角色。