二磷酸核苷鼠李醣生合成基因的功能與生化特性之研究

Abstract

二磷酸核苷L-鼠李醣(NDP-L-rhamnose)是由三磷酸核苷(NTP)和D-葡萄醣-1-磷酸(D-Glucose-1-phosphate)經過四個生物合成酵素(Gtt、Gdh、Epi和Kre)催化合成。在微生物以及植物中皆有發現鼠李醣，但在人體中並無此特殊醣類。 Saccharopolyspora spinosa為一革蘭式陽性(Gram-Positive)菌，本論文研究利用試管內實驗來重組並證明此菌株鼠李醣的生物合成途徑與酵素的生化特性。 在本研究中，我們將S. spinosa之二磷酸核苷L-鼠李醣生物合成途徑中的酵素相關表現質體建構完成，將質體轉型到異種宿主(Heterologous host)大腸桿菌中，並將質體表達在不同的溫度、時間以及不同濃度的IPTG (isopropyl-b-d-thiogalactopyranoside)下，誘導產生蛋白質，並分析蛋白質的表達狀態，找尋獲得最多可溶性蛋白質的最佳條件；然後大量表達並純化蛋白質，再利用試管內的生合成實驗來證明酵素的催化活性、生化功能及特性；實驗中亦大量製備酵素產物，以核磁共振光譜儀及質譜儀輔助鑑定生合成酵素產物之結構。