應用石英微量天平元件檢測人類乳突病毒

Abstract

研究背景：許多DNA感測器是應用固定在基質上的探針（probe）與溶液中之標的（target）DNA進行雜交反應的原理來運作，例如DNA晶片、DNA感測器及DNA電腦等。此外，目前已有許多技術可用於DNA檢測，螢光標定的寡核□酸鏈（oligonucleotide）、表面電漿共振儀與電化學分析等方法均可應用於雙股DNA的雜交。壓電石英震盪微天平(quartz crystal microbalance; QCM)也是一種可運用於DNA感測的系統，在本實驗中我們建立一套應用QCM的感測系統，根據DNA序列雜交的專一性來偵測16與18型的人類乳突病毒(human papillomavirus; HPV)。 方法與結果：我們設計了對HPV具專一性的probe及欲檢測的target序列，其皆為30-mer的鹼基所構成。Probe 16與Probe 18的oligonucleotide在其5’端以一具有六個碳的硫醇基做修飾，此使之可共價鍵結於QCM的金薄膜表面上。在針對HPV 16型的檢測中，我們合成四條target序列：Type 16，是一可完全互補於（perfect match, PM）Probe 16的oligonucleotide；Type 6，與Probe 16具有三個不配對鹼基（3 internal mismatches, 3-MM）；Type 51（7-MM）；*Probe 16，則為與Probe 16完全不配對的序列（no match; NM）。在針對HPV 18型的檢測中，我們也是合成四條target序列：Type 18（PM）、Type 45 (4 MM)、Type 6 (6 MM)及*Probe 16 (NM) 。在QCM的量測中，由DNA吸附或是DNA雜交在QCM表面所造成的質量增加量，可利用頻率變化量代入Sauerbrey方程式來計算。在本實驗中所使用的QCM，一Hz的頻率變化量相當於1.068 nanogram重量的變化。 我們將QCM直接浸泡在含有1 μM probe的溶液(1 M Na2HPO4)中，以進行probe的固定化反應，再將結合有probe的QCM分別浸入含有四種不同target序列的溶液(1 M NaCl and PBS pH 7.0)中，在室溫下進行雜交反應，反應後再清洗並量測其頻率變化。在固定probe前的基頻，固定後的頻率及與target序列雜交後的頻率均會被測量，以計算target序列與QCM上probe（Probe 16或Probe 18）序列雜交的效率（%）。在Probe 16的測定中，target序列Type 16 (PM)、Type 6 (3 MM)、Type 51 (7 MM)及*Probe 16 (NM)的雜交效率分別是91 □ 1%，48 □ 5%，26 □ 2% 及 4 □ 1%；在Probe 18的測定中，target序列Type 18 (PM)、Type 45 (4 MM)、Type 6 (6 MM)及*Probe 16 (NM) 的雜交效率分別是93 □ 3%、49 □ 1%，17 □ 6%及9 □ 4%。 在本實驗中，我們也利用奈米金球來放大QCM系統中的偵測訊號。我們針對HPV 18的序列設計了兩條具專一性的probe，Probe 1 (23-mer)與Probe 2 (20-mer)，一條target序列，Target 18 (65-mer)。Probe 1結合在QCM的金薄膜電極上，Probe 2結合在奈米金球上，Target 18與位於QCM上的Probe 1及奈米金球上的Probe 2雜交，並將兩者連結。雜交結果顯示使用奈米金球可顯著放大 DNA雜交訊號，該訊號為未使用奈米金球者的四倍以上。 結 論：共價鍵結於QCM上金薄膜電極的probe可被用來進行DNA雜交測定，並經由頻率改變量來計算probe與target的雜交效率。在本實驗中，我們得以定量出QCM金薄膜表面上的probe與target雜交後的質量變化量，我們的結果也顯示利用QCM來偵測HPV序列的可行性。藉由此方法，我們成功的偵測出HPV 16和HPV 18，而在奈米金球放大訊號的實驗中，我們也成功的偵測到更顯著因DNA雜交作用所產生的石英頻率變化結果。