酪胺酸酵素反應機構的探討

Abstract

在這份研究計畫中，主要探討有關酪胺酸酵素活化中心的蛋白質結 構與反應機構的關係。整個研究過程分為二年，依次為：第一年，酪胺酸 酵素的取得及酪胺酸酵素中-2:2 過氧雙銅穩定度的研究；第二年，酪胺 酸酵素對反應物質的選擇性。所選用酪胺酸酵素來自Stretomyces avermitilis MA-4680，主要是使用分子克隆(molecular cloning)的方法，將酪胺酸酵素 的基因置入大腸桿菌，由大腸桿菌大量表達酪胺酸酵素，在經由管柱層析 (FPLC)純化酪胺酸酵素。酪胺酸酵素中-2:2 過氧雙銅穩定度的研究，主 要是探討四個位於活化中心附近疏水性氨基酸Phe59、Trp62、Phe212 及 Trp226，其功能是否是維持活化中心疏水性，來穩定-2:2 過氧雙銅(II) 於酪胺酸酵素中。有關酪胺酸酵素對反應物質的選擇性，主要針對氨基酸 Thr203 是否影響物質進入活化中心，利用定點突變的方法，將此氨基酸改 變成其他的氨基酸。於反應中，除了使用一般酚類外，亦嘗試各種醇類、 氨類，來探討酪胺酸酵素對物質的選擇性。產物的分離是利用HPLC，分 離後產物利用NMR 來決定其結構，並用Mass 來決定分子量。預期觀察到 的結果氨基酸Thr203 定點突變成其他氨基酸，會使得胺酸酵素反應的選擇 性改變。