T7 DNA聚合酶的兩個次單元體―基因5蛋白和Thioredoxin間的交互作用與活性之探討

Abstract

T7 DNA聚合酶系統由於具有相當高的DNA聚合複製能力，因此一直是科學家們研究聚合酶與DNA作用關係的重要工具。T7 DNA聚合酶具有兩個次單元體，分別是由噬菌體T7所產生的基因5蛋白及存在大腸桿菌內的Thioredoxin蛋白所組成，能夠合成DNA長達數千個核苷酸。根據前人研究顯示噬菌體T3及T7的基因5蛋白有高達97%相似度的氨基酸序列，因此本實驗著重在T3/T7 基因5蛋白和Thioredoxin間的作用關係。噬菌體T3/T7主要以T3 DNA序列為主，而其中有一小段為噬菌體T7的相對基因所取代，因此產生的基因5蛋白將能與噬菌體T3及T7的基因5蛋白做比較。本實驗先將能造成回復感染的噬菌體突變株上的基因5 DNA純化出來，並以感染的方式觀察基因5蛋白和Thioredoxin的交互作用對於噬菌體感染效率的影響。在證實回復感染作用是導因於基因5蛋白的突變因素後，開始進行噬菌體T3、T7及T3/T7野生株還有能回復感染的T3/T7突變株上基因5蛋白的表現與純化。另外為了研究與Thioredoxin間的交互作用關係，亦進行了能提高最大感染效率的Thioredoxin突變株蛋白的表現與純化。在經過對各蛋白的定量分析後，最後以酵素活性分析來觀察兩蛋白間的作用結果。在相同酵素濃度的作用下，可看出不同突變位置的基因5蛋白在與相對應的Thioredoxin作用下具有不同的延展活性。三組野生株具有相近的高DNA延展性，而突變株在延展性上除了較野生株低外，各突變株又以基因5-D366A/TrxA-P34L具有較好的延展性，推測此位置在兩蛋白的交互作用上，具有較高的酵素活性影響力。