家族54阿拉伯呋喃糖苷酵素之反應機制探討

Abstract

本研究利用之前已發展完善的純化流程，純化出α-L-阿拉伯呋喃糖苷酵素，均質度在90% 以上，酵素單體分子量約50 kDa。 針對α-L-阿拉伯呋喃糖苷酵素，我們合成一系列含有不同離去基之受質以動力學之研究以探討其特異性及反應機制。同時也合成此酵素之可能抑制劑，1,2-epoxy-3-(α-L-arabinofuranosyl)propane進行抑制反應研究。 以不同受質與酵素進行催化反應，在反應系統內加入相同比例之甲醇讓酵素同時進行轉醣反應，反應結果顯示酵素以構型保留之方式進行催化，由NMR光譜分析得知酵素催化的過程經過共同的反應中間體 (common intermediate)，此中間體可能是阿拉伯醣基化酵素中間體。 以受質離去基之pKa與log kcat及log kcat / Km 作圖可得Brǿnsted plot。由Brǿnsted plot 及共同反應中間體可推論此酵素之催化機構為兩步驟取代反應，即為酵素醣基化(arabinosylation)及去醣基化(dearabinosylation)。由於其βlg=-0.19左右，顯示離去基的強弱在催化過程中並非速率決定步驟，以蛋白質結構分析得知E223與D299是此酵素重要胺基酸殘基，我們因此以D299G突變酵素進行Brǿnsted plot研究，並得βlg=-1.3左右，顯示除去D299後催化反應之速率決定步驟改變為醣基化步驟。 很可惜的是1,2-epoxy-3-(α-L-arabinofuranosyl)propane無法與酵素作親和性的標誌，無法明確地用以定位重要胺基酸，但其為競爭形抑制劑， Ki值為4.85 mM。